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蛋白上游研究之Sanger測序原理與方法

瀏覽次數:4367 發布日期:2017-4-26  來源:原創

在分子生物學研究中,DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于DNA測序的技術主要有Frederick Sanger發明的Sanger雙脫氧鏈終止法(Chain Termination Method)。快速DNA測序方法的出現極大地推動了生物學和醫學的研究和發現。

測序原理

利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物,直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成,每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團,使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點,終止點由反應中相應的雙脫氧而定。

測序方法

基因分析儀(即DNA測序儀),采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳,應用四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法),因此通過單引物PCR測序反應,生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳,從而避免了泳道間遷移率差異的影響,大大提高了測序的精確度。

由于分子大小不同,在毛細管電泳中的遷移率也不同,當其通過毛細管讀數窗口段時,激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測,激發的熒光經光柵分光,以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,并在CCD攝影機上同步成像,分析軟件可自動將不同熒光轉變為DNA序列,從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。

測序設備

DNA測序儀(3730xl DNA Analyzer),性能特點,自動化程度高,提供連續、無需監控的操作,自動灌膠、上樣、電泳分離、檢測及數據分析,可連續運行24小時無需人工干預。樣品分析量大,一束毛細管可同時對96個樣品進行全自動分析,一天可完成數百個樣品的測序或片段分析工作。

先進的熒光檢測系統,采用光柵分光,CCD攝像機成像技術,實現多色熒光同時檢測,與傳統的濾鏡及光電倍增管的檢測方式相比,光柵及CCD的優勢在于更新熒光化學時無需更換任何硬件設備。從激光光源發出的光線被光學元件分成兩股,96根毛細管被一束激光同時從兩面照射,有效提高熒光檢測靈敏度和均一性。

測序流程

發布者:武漢金開瑞生物工程有限公司
聯系電話:027-62431110
E-mail:3013422302@qq.com

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