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重組酶聚合酶擴增(RPA)技術簡介

瀏覽次數:9337 發布日期:2015-10-12  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

核酸檢測革命:可替代PCR的犀利技術——RPA

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性,最佳反應溫度在37°C左右。

RPA原理介紹

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成,對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合,防止進一步替換。在這個體系中,由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快,一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。

RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的,因為RPA引物比一般PCR引物長,通常需要達到30-38個堿基。引物過短會降低重組率,影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時,變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟,用戶需要自己摸條件進行優化。

RPA技術有哪些優勢

常規PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟,而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的最適溫度在37℃-42℃之間,無需變性,在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要溫控設備,RPA可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。

據介紹,RPA檢測的靈敏度很高,能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平,從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理,適用于無法提取核酸的實地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA,還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產物進行終點檢測,還可以對擴增過程進行實時監控,甚至可以通過試紙條(側流層析試紙條LFD)讀取結果。

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