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細胞技術專題:原代胚胎成纖維細胞培養

瀏覽次數:1102 發布日期:2014-4-17  來源:上海北諾生物科技有限公司

實驗器材

手術小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網、50ML、15ML離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

實驗試劑

無Ca2+和Mg2+的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細胞(MEF)生長培養基:高糖DMEM加10%FCS。

實驗動物

孕期14至16天的孕鼠

實驗步驟

1. 處死孕鼠,置于75%酒精里全身浸泡,然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開,用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開,露出子宮,最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中,沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除,然后夾掉頭和內臟,將其余胚胎轉移到一個裝有30MLPBS的50ML離心管中,輕輕顛倒兩次,倒掉PBS,再重復此步驟一次,留少許PBS將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中,用手術刀片將其細細切碎。

3.用200ul的移液槍反復快速吹打平皿中的液體,放在15ML離心管中,4℃1500rpm離心5分鐘,倒掉上清,加10ML胰酶,重懸沉淀,放37℃水浴中消化30分鐘,且每隔五分鐘輕輕晃動,使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養基的50ML離心管中,用200目尼龍濾網過濾后,1500rpm離心5分鐘收集細胞。30ML MEF生長培養基洗滌兩次(此步驟中作者試過用無血清的培養基洗滌,結果無差別)。

5.細胞沉淀用15ML生長培養基懸起,細胞計數(八只14天胎鼠可獲得2-3×107細胞)。

6.3×106細胞懸浮于15ML MEF生長培養基中,接種到200ML的培養瓶中。

7.24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。

8.細胞長滿后,先用PBS沖洗,倒掉,加胰酶消化(此步時間不宜過長,作者一般不超過五分鐘),按1:5傳代。

9.細胞再次長到覆蓋率80-90%左右,將其消化后,常規凍存。(凍存液要現配)

五、討論

1.原代培養,一定要避免污染。

2. MEF生存能力有限,如果不凍存,體外存活十代左右。

3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次,因為這些細胞繁殖能力有限。

4. 消化細胞時間不要過長。

發布者:上海北諾生物科技有限公司
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