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感受態制備:酵母感受態細胞制備實驗

瀏覽次數:1459 發布日期:2013-10-30  來源:上海北諾生物科技有限公司

酵母感受態細胞制備可以:(1)用于建立酵母轉化體系;(2)用于酵母表達系統構建;(3)用于酵母其他分子生物學研究。

實驗方法
  • 化學法
  • 試劑盒制備法
實驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實驗步驟
一、試劑與耗材

1.  試劑
 
細菌用-酵母提取物(Fisher)、 細菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、細菌用-瓊脂粉、去離子水、甘油(Sigma)、二甲基亞砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸鋰(Sigma)、鮭魚精子細胞DNA(Invitrogen)、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
 
2.  儀器
 
水浴鍋(VWR)、離心機(Eppendorf)、30 °C搖床與恒溫培養箱(VWR)、培養皿。

二、 試劑配方
 
1.  YPDA液體或固體培養基
 
(1)1%酵母提取物: 10 g/L
 
(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
 
(3)2%葡萄糖:20 g/L
 
2.  轉化液
 
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl
 
(2)1 M醋酸鋰:36 μl
 
(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl
 
(4)質粒:3 μl
 
(5)總計:360 μl
 
3.  YNB+ MA 培養基(100 ml)
 
(1)YNB:0.67 g
 
(2)2-(N-嗎啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
 
(3)腺嘌呤:0.01 g
 
(4)瓊脂粉:2g
 
(5)葡萄糖:2g
三、制備步驟
 
1.  在轉化實驗的兩天前,于YPDA培養基的平皿上活化酵母菌株。
 
2.   轉化前一天,挑取活化的酵母細胞(單克隆)于YPDA液體培養基中,30°C,200 rpm培養過夜。
 
3.  將培養過夜的酵母細胞液按1:3的比例轉接與新的YPDA液體培養基中,于30°C搖床內,200 rpm培養4 h。
 
4.  3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細胞,用0.5倍體積的無菌水洗酵母細胞。
 
5.  再次3 000 g 離心 5分鐘。
 
6.  用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細胞,并轉入適宜的離心管中,20°C ,3 000 g 離心 5分鐘。
 
7.  用0.01倍體積的無菌細胞懸浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細胞。
 
8.  將重懸的酵母細胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
 
9.  將管放入塑料盒或者紙盒中(逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率)。
 
10.  將裝有酵母細胞的盒子放入-80°C冰箱。(細胞在-80°C能夠保存一年以上)。
 
收起 
其他
一、參考文獻
 
1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
 
2.   Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
發布者:上海北諾生物科技有限公司
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