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ESI Q-TOF質譜分析PEG化蛋白藥物方法簡介

瀏覽次數:2427 發布日期:2012-3-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
-- 賈偉    沃特世科技(上海)有限公司實驗中心
 
PEG修飾蛋白及多肽類藥物后,可在不產生毒性、不損害藥效的情況下,通過增加蛋白類藥物的溶解性、減少免疫原性、增加穩定性、延長體內藥物半衰期等功效增強大分子藥物的療效。PEG的這種功效在1970年代后期被發現,到了1990年PEG化修飾的Adagen被美國FDA批準,至今已有若干個PEG修飾的大分子藥物上市銷售,這些藥物在癌癥、肝炎、痛風、糖尿病等疾病治療中為患者帶來了福音。
 
明確PEG修飾位點、確定修飾位點的數量、以及表征PEG的聚合度分布性是PEG化大分子藥物運用于臨床前以及藥品質量監控必須且非常重要的工作。由于PEG的高分子聚合物性質,由PEG修飾后的蛋白及多肽的結構變得極為復雜。在早期對其進行質譜分析,特別是對PEG的聚合度分布性分析方面,多使用MALDI離子源類型的質譜。這是因為MALDI源離子化的樣品,所帶電荷數較少(單電荷離子居多),因此其質譜圖相對簡單;而通過ESI源離子化的樣品將攜帶多個電荷,這使離子信號復雜,致使其質譜圖譜較難解析。隨著LC-ESI技術的發展, 美國Indiana大學的Lihua Huang等學者通過在色譜分析柱后加胺的技術,使樣品的ESI離子化時的荷電數適當減少,從而使PEG化樣品的ESI圖譜得到高效的解析[1]。而MALDI TOF類質譜由于質譜分辨率的限制(目前MALDI TOF分辨率在8萬內),面對分子量動輒十幾萬甚至更高的PEG化蛋白,其可獲得的數據質量較差,因而MALDI方法可得到的PEG化蛋白的有效結構信息非常有限。
 
Lihua Huang等學者進一步開發了ESI Q-TOF分析PEG化蛋白的修飾位點的質譜方法[2]。這種方法包括源內裂解(ISF,In Source Fragmentation)與二級質譜(MS/MS)兩個步驟。在第一步ISF過程中,PEG化多肽的PEG部分被裂解而變短;在第二步MS/MS過程中,多肽被打碎產生b、y離子碎片。通過分析攜帶縮短的PEG鏈的b、y離子信息,最終得出確切的PEG化修飾位點。ISF與MS/MS為什么可以分別 “選擇”碎裂PEG化多肽的PEG與多肽兩個部分呢?推測與PEG化多肽的電荷分布有關。在PEG化多肽的離子化過程中,PEG的醚鍵附著了大量的H+,并在ISF下完全斷裂,而使冗長的P EG鏈縮短到一兩個單位大小。之后的MS/MS過程中,由于縮短的PEG鏈已無H+附著不再斷裂。而多肽在MS/MS中獲得了碎裂的機會,并產生攜帶“PEG短標簽”的b、y離子碎片。論文中,研究人員運用此方法成功地分析了IgG4與胰高血糖素的PEG修飾位點。

參考文獻
(1) Huang L, Gough PC, Defelippis MR. Characterization of Poly(ethylene glycol) and PEGylated Products by LC/MS with Postcolumn Addition of Amines. Anal Chem. 2009, 81, 567-577.
(2) Lu X, Gough PC, DeFelippis MR, Huang L. Elucidation of PEGylation site with a combined approach of in-source fragmentation and CID MS/MS. J Am Soc Mass Spectrom. 2010, 21, 810-818
發布者:沃特世科技(上海)有限公司
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