九叔归来3魁蛊婴在线观看_男人躁女人到高潮AV_香港成人论坛_亚洲精品久久久久久偷窥_夜来香成人网_亚洲制服 视频在线观看_无毒黄站_国产传媒18精品A片一区_麻花豆传媒剧国产MV在线观看_东北60岁熟女露脸在线_国产高清视频在线观看97_一道本视频一二三区_yellow免费播放在线观看_浪漫樱花动漫在线观看官网_高清AV熟女一区_天堂在线www_亚洲第一成年人网站_黄色在线免费观看_av女优快播_久久精品99国产精品日本

English | 中文版 | 手機版 企業登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
當前位置 > 首頁 > 技術文章 > Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析

Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析

瀏覽次數:4735 發布日期:2011-3-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
Western Blot過程中常見的問題及可能原因分析
問題
可能原因
驗證或解決辦法
背景高
膜沒有完全均勻濕透
使用100% 甲醇浸透膜5-10min
洗膜不充分
增加洗液體積和洗滌次數
阻斷不充分
增加封閉液孵育時間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑(脫脂奶粉,BSA,酪蛋白等)
二抗濃度過高
降低二抗濃度
檢測過程中膜干燥
保證充分的反應液,避免出現干膜現象
曝光過度
縮短曝光時間
抗體與阻斷蛋白有交叉反應
檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性,選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應
沒有陽性條帶,或者陽性條帶比較弱
抗體染色不充分
增加抗體濃度,延長孵育時間
酶失活
直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。
試劑不匹配
一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性
一抗失效
選擇在有效期內抗體;并選擇現配現用的工作液
HRP抑制劑
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉
膜沒有完全均勻濕透
使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10Kd
選擇小孔徑的膜,縮短轉移時間
甲醇濃度過高
過高甲醇濃度會導致蛋白質與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同時會使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
轉移時間不夠
對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間
抗體染色不充分
增加抗體濃度,延長孵育時間
標本中靶蛋白含量太低
增加標本上樣量。
HRP抑制劑
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉
抗體活性降低
選擇在有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置
封閉過度
減少封閉劑的量或縮短時間;換用不同封閉劑類型
曝光時間過短
延長曝光時間
條帶位置不對;或有非特異性條帶
色帶)
二抗的非特異性結合
增加一個對照:不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗(特異性更強的,只針對重鏈的)
一抗的特異性不夠
使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性
蛋白降解
使用新鮮制備的標本,并使用蛋白酶抑制劑
二聚體或多聚體存在
增加蛋白質變性過程及強度
抗體濃度過高
降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶
蛋白上樣量過大
降低上樣量
封閉劑中有聚集體
使用前過濾封閉試劑
HRP耦聯二抗中有聚集體
過濾二抗試劑,去除聚集體
HRP含量過高
降低酶聯二抗的濃度
發布者:巴傲得生物科技有限公司上海分公司
聯系電話:021-50327163
E-mail:yonghong1028@126.com

用戶名: 密碼: 匿名 快速注冊 忘記密碼
評論只代表網友觀點,不代表本站觀點。 請輸入驗證碼: 8795
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com
主站蜘蛛池模板: 景东| 青海省| 开远市| 泸西县| 清远市| 交城县| 扎鲁特旗| 西乌| 太原市| 巫溪县| 兴城市| 临泽县| 广安市| 江源县| 镇远县| 青岛市| 张北县| 远安县| 彰化市| 金门县| 云南省| 秦皇岛市| 年辖:市辖区| 丰台区| 新安县| 思茅市| 界首市| 马龙县| 满城县| 延寿县| 鹤峰县| 惠水县| 维西| 卢湾区| 新化县| 嘉峪关市| 林西县| 大安市| 婺源县| 通许县| 清新县|