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正常人關節軟骨細胞的長期培養

瀏覽次數:2566 發布日期:2010-9-13  來源:www.pricells.com.cn
正常人關節軟骨細胞的長期培養
 
實驗材料:
1.    軟骨細胞來源:20—24周自然流產胎兒的股骨和脛骨;
2.    清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,pH7.2;
3.    消化液Ⅰ:2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml膠原酶混合消化液,用PBS液配制;
4.    消化液Ⅱ:0.5mg/ml膠原酶,用培養液Ⅰ配制;
5.    培養液Ⅰ:DMEM培養液,補充10%胎牛血清;
6.    培養液Ⅱ:DMEM培養液中補加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、鏈霉素1mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%維生素添加劑(vitamin supplements)以及維生素C 50μg/ml;
7.    10% poly HEMA:稱取6g多聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯(2-hydroxyethylmethacrylate,poly HEMA),加到50ml 95%乙醇中,于37℃恒溫振蕩水浴箱中緩慢振蕩過夜,次日將所得溶液離心(2500r/min,10min),除去未溶解的顆粒,此為干液。取1ml干液與9ml 95%乙醇混合,稀釋成10%(V/V)的poly HEMA溶液;
8.    篩網:孔徑為100μm的尼龍篩網;
 
實驗方法:
1.    在無菌條件下,從20—24周自然流產胎兒的股骨頭和脛骨坪切取骺軟骨。用PBS液洗凈血液。盡量除去纖維性組織;
2.    將軟骨放入消化液Ⅰ中,于37℃孵育1h;
3.    棄孵育液。將軟骨塊充分切碎,加入消化液Ⅱ,在37℃孵育過夜;
4.    用尼龍篩網過濾,濾液中加入培養液Ⅰ。再經250g離心5min,棄上清液;
5.    用培養液Ⅰ將細胞團吹散,重新懸浮細胞,離心。重復4次。用培養液將最后得到的細胞團制成懸液;
6.    計數細胞。從每克軟骨平均可獲得大約3.0×108個軟骨細胞;
7.    取0.9ml 10% poly HEMA溶液鋪在直徑為60mm的塑料培養皿內,水平放置在通風的超凈工作臺上干燥(過夜);
8.    使用前將包被poly HEMA的培養皿用滅菌紫外燈照射30min;
9.    將含5×106個軟骨細胞的懸液接種到已包被poly HEMA的培養皿中,在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中培養;
10.每3—4d換一次液。培養可持續半年以上;
 
發布者:武漢原生原代生物醫藥科技有限公司
聯系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

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