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正常成熟破骨細胞原代培養

瀏覽次數:2861 發布日期:2010-9-8  來源:www.pricells.com.cn

正常成熟破骨細胞原代培養

實驗材料:

1. 細胞來源:新生大鼠或兔,妊娠6個月以內的引產胎兒等;

2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素,pH7.2;

3. 細胞支持物:薄骨片、蓋玻片;

4. 培養液:199培養基、MEM或DMEM培養基均可,須補加15%—20%小牛血清、25mmol/L HEPES及青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml;

實驗方法:

1. 薄骨片的制備:取新鮮牛股骨干的密質部分,沿骨縱軸用骨鋸切割成大小約0.5cm×0.5CM、厚為0.1cm的小塊,再用金剛砂輪磨成厚約10—50μm(以便在相差顯微鏡下觀察)的薄骨片。使用前用超聲波清洗儀超聲洗滌3次,每次約10min。然后依次浸泡在3個盛有含青霉素(1000IU/ml)、鏈霉素(1000μg/ml)、兩性霉素B(3μg/ml)的抗生素溶液的小容器中,每次10—20min。最后可浸于盛有含抗生素的培養液的容器內,置4℃(短期)或-20℃(較長期)冰箱內保存備用;

2. 取生后3—5d的大鼠,拉頸處死后置于盛有75%酒精的容器中,消毒3—5min后,取出放入培養皿中;

3. 用手術剪剪開其四肢皮膚、肌肉,取股骨和脛骨等長骨,放入盛緩沖液的培養皿中。除去骨表面的軟組織、骨膜以及軟骨;

4. 將除去骨膜等多余組織后的長骨干部分清洗后,置于盛有少量培養液的培養皿中。用手術刀或手術剪縱行剖開骨干。用手術刀輕刮骨的內表面,同時用尖吸管不斷吸取培養皿中的培養液,沖洗骨內表面多次,直至骨內表面變白為止;

5. 用吸管吸打上述含碎骨片及分離細胞的培養液2—5min左右,使附著于碎骨片上的破骨細胞分離脫落于培養液中。靜置1—2min后,待碎骨片沉降,收集細胞懸液;

6. 將細胞懸液加入到預置有薄骨片或蓋玻片的24孔培養板中,在37℃、5%CO2培養箱中培養;

7. 培養30min左右,取出薄骨片或蓋玻片用培養液沖洗以除去未附著的骨髓造血細胞。沖洗后,將薄骨片或蓋玻片移入另一培養板中繼續培養;

發布者:武漢原生原代生物醫藥科技有限公司
聯系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

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