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用凍融法制備的Nycodenz予形成梯度分離細(xì)胞器

瀏覽次數(shù):3915 發(fā)布日期:2008-12-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

用密度梯度離心分離亞細(xì)胞構(gòu)造往往需要預(yù)先制備蔗糖或其他合適梯度材料的密度梯度,操作比較復(fù)雜。利用新型的梯度材料Nycodenz (Norway,Nycomed pharma AS公司)用凍融法制備凸指數(shù)與凹指數(shù)共存的曲線梯度,利用超速離心機(jī)的水平轉(zhuǎn)頭可以簡便地分離出亞細(xì)胞構(gòu)造中線粒體,高爾基復(fù)合體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(滑面及糙面),溶酶體及過氧化酶體。離心分部收集后分別做SDS—PAGE電泳可以明顯地看出細(xì)胞器的分布情況。
設(shè)備:超速離心機(jī)(日立CP—MX,CP—WX或其他品牌新型機(jī))
轉(zhuǎn)頭:R28S 甩平轉(zhuǎn)頭
離心管:40PA
密度梯度儀:日立DGF—U用于自上而下從離心管抽出分離液至分部收集器
分部收集器、密度測定設(shè)備、電泳儀等常規(guī)設(shè)備。
樣品:鼠肝勻漿,每管加3.5ml (濃度—14mg/ml )
步驟:
1.Nycodenz梯度制備:
   每管用Nycodenz 稀釋配置液20% w/v (1.105g/ml) 32ml 放入-20℃冰箱凍結(jié)。全部凍結(jié)后取出室溫中融化即成為(從液面到管底)密度從1.04g/ml 到 1.27/ml 的曲線型      (從 1.05g/ml 到1.13g/ml 為凸指數(shù)型,從 1.13g/ml 到1.27g/ml 為凹指數(shù)曲線)連續(xù)梯度。
2.加樣:在連續(xù)梯度上鋪樣品至距管口3mm(約3.5ml)
3.離心:日立R28S甩平轉(zhuǎn)頭,6×40ml 鈦合金吊桶,40PA管,25,000rpm (82,200xg),4℃離心3小時,加速“8”,減速“7”
4.收集:離心后每管分別用日立DGF—U上取法自動收集至分部收集器也可以人工收集(自上而下),收集管每管約0.5—0.75ml (即40PA 離心管收集成52—78管)
5.測密度:測定每管的密度值,按管數(shù)→密度繪成曲線
6.電泳:每管取3 ul 做SDS—PAGE 電泳,并標(biāo)定管數(shù)對應(yīng)密度及分子量的重疊曲線。
7.分析:根據(jù)密度分布可以繪出高爾體復(fù)合體,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體,溶酶體及氧化酶微體(注意內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微體由于他們的密度及大小不同,可能都會有二個區(qū)域的分布)的分布區(qū)域,由于它們在Nycodenz 中浮密度的重疊,分布的區(qū)域也會有所重疊。

參考文獻(xiàn):
1.K.Murayama 等  “Electrophoresis”  2001,Vol:22   PP  2872—2880
2.Hitachi KoKi,Scientific Inst.Division,“himac Application” NO:110,2003.1

作者:余興明   電話:13764301893,yuxingming@techcomp.cn


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