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AUTOMACS系統自動分選體系分選小鼠CD4+ CD25+抑制性細胞

瀏覽次數:2236 發布日期:2010-6-18  來源:www.pricells.com.cn
PriCells-AUTOMACS系統自動分選體系分選小鼠CD4+ CD25+抑制性細胞
 
由此方法得到的陰性細胞(CD4+ CD25-)可用作反應細胞或對照細胞
 
實驗材料:
1.    小鼠
2.    HBSS洗滌緩沖液
3.    MACS緩沖液
4.    CD8a(Ly-2)磁珠
5.    結合緩沖液
6.    biotin-抗CD25(7D4)
7.    Streptavidin-PE
8.    抗PE磁珠
9.    完全RPMI培養基
10.    小鼠CD3+T細胞富集柱和1×純化柱緩沖液
11.    15ml離心管,無菌
12.    autoMACS系統和分選柱
13.    30mm尼龍網或40mm預分離濾膜
 
實驗方法:
1.    用20只小鼠的淋巴結制備單細胞懸液并去除紅細胞。
2.    將細胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數器計數。
3.    將細胞懸液在4℃,200g離心10min。離心過程中,準備3支小鼠CD3+T細胞純化柱,按說明書的指導用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液,在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。
4.    用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細胞。將細胞通過30mm尼龍網或40mm預分離濾膜后,每支純化柱中加入2ml細胞。室溫孵育15min。
5.    用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細胞。用血細胞計數器計數后,將細胞懸液在4℃,200g離心10min。
6.    將沉淀按每108個細胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個細胞加入0.1ml CD8a(Ly-2)磁珠后4℃孵育15min。
7.    4℃,200g離心10min。
8.    以MACS緩沖液混懸細胞,使細胞濃度達到108個細胞/ml。將細胞通過30mm尼龍網或40mm預分離濾膜。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇depletes程序(CD4+ T細胞將從陰性通道洗脫。
9.    回收細胞計數,在4℃,200g離心10min。
10.    用結合緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入15mg biotin-抗CD25(7D4)。4℃孵育15min。4℃,200g離心10min。
11.    用結合緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
12.    4℃,200g離心10min.
13.    用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。每108個細胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
14.    4℃,200g離心10min。
15.    用MACS緩沖液混懸細胞使其濃度達到108個細胞/ml。將細胞放到autoMACS的上樣通道。選擇posseld程序(CD4+ CD25+細胞將從陽性通道洗脫,CD4+ CD25-細胞將從陰性通道洗脫。
發布者:武漢原生原代生物醫藥科技有限公司
聯系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

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