檢測鐵死亡的方法包括：檢測代謝反應（如脂代謝、鐵代謝和 GSH 相關代謝）相關標志物含量變化、細胞形態變化、和分子蛋白含量/活性變化。

01
脂代謝相關生物標志物檢測

過度的脂質過氧化通過產生有毒的磷脂氫過氧化物（PLOOH），在促進鐵死亡中起著重要作用。因此，脂質過氧化相關的生物標志物是鐵死亡的關鍵檢測指標。

1.1 脂質過氧化物檢測

BODIPY 581/591 C11 是一種脂溶性比率型熒光探針，能夠嵌入細胞膜并與細胞內的脂質相互作用。在未氧化狀態下，呈現紅色熒光 (還原型；Ex=581 nm, Em=591 nm)。

當細胞發生鐵死亡時，亞鐵離子 (Fe2+) 和 ROS 促進脂質氧化，形成脂質過氧化物，BODIPY 581/591 C11 被氧化，發射波長從 591 nm 轉移到 510 nm，產生綠色熒光 (氧化型；Ex=500 nm, Em=510 nm)。

需要注意的是，BODIPY 581/591 C11 對脂溶性膜內各種活性氧 (ROS) 和過氧亞硝酸鹽 (ONOO-) 也較為敏感，因此它也可以用于鐵死亡細胞中 ROS 和 RNS 的檢測。

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BODIPY 581/591 C11 染色參考

1. 儲備液及工作液的制備:
 (1) 用 DMSO 配制 10 mM BODIPY 581/591 C11 儲備液（-20°C 或 -80°C 避光保存，避免反復凍融）。
 (2) 染色前用無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲備液，制備 2-10 μM BODIPY 581/591 C11 工作液（請根據實際情況調整工作液濃度）。

2. 細胞染色：
(1) 細胞制備
懸浮細胞：4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
貼壁細胞：棄去培養基，加入胰蛋白酶解離細胞，制成單細胞懸液。4°C, 1000 ×g 離心 3-5 分鐘，棄上清。
PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
 (2) 加入 1 mL BODIPY 581/591 C11 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
 (3) 4°C, 400 ×g 離心 3-4 分鐘，棄上清。PBS 洗 2 次，每次 5 分鐘。
 (4) 用 1 mL 無血清細胞培養基或 PBS 重懸細胞，熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

1.2 活性氧的檢測[20]

活性氧（ROS） 在鐵死亡過程中不僅促進脂質過氧化和細胞損傷，還抑制抗氧化信號通路，是鐵死亡檢測的重要生物標志物。H2DCFDA（DCFH-DA）是一種可滲透細胞的活性氧探針。進入細胞后，H2DCFDA 在細胞內脫酯化，并被 ROS 氧化成具有強烈熒光的 DCF，產生綠色熒光（Ex: 488 nm, Em: 525 nm）。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或分光光度計等設備可以檢測細胞內 ROS 水平。
 
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H2DCFDA 染色方法參考

1. 儲備液及工作液的制備 :
 (1) 用DMSO配制5mM的H2DCFDA儲備液（-20°C或 -80°C避光保存，避免反復凍融）。
 (2) 染色前用無血清細胞培養基或PBS稀釋儲備液，配制成1-10μM的H2DCFDA工作液。（請根據實際情況調整工作液濃度）。

2. 細胞染色：
 (1) 懸浮細胞
· 離心收集細胞，保持密度約為1×106個。PBS洗滌兩次，每次5分鐘。
· 加入1mL 染料工作液，室溫孵育5-30分鐘。
· 400×g離心3-4分鐘，棄上清。PBS洗滌細胞兩次，每次5分鐘。
· 用1mL無血清培養基或PBS重懸細胞，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。
 (2) 貼壁細胞
· 將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。
· 從培養基中移出蓋玻片，置于載玻片上，吸除多余培養基。加入 100 μL 染料工作液， 輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。
· 吸去染料工作液，培養基洗 2-3 次，每次 5 分鐘，使用熒光顯微鏡觀察。
注：若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化并重懸后再進行染色。
 
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1.3 過氧化脂質衍生物的檢測[21][22]

脂質過氧化反應過程中，大量的脂質過氧化初級產物在氧化反應中逐漸分解為一系列復雜的醛類化合物，包括 MDA，4-HNE，丙醛和己醛等。這些活性醛類物質能夠攻擊蛋白質等生物大分子，形成加合物，從而引發細胞的進一步損傷。

Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit 是一種基于硫代巴比妥酸 (TBA) 反應物法的試劑盒，脂質過氧化產物 MDA 與 TBA 在高溫和酸性條件下反應，形成一種具有特定顏色的 MDA-TBA 復合物，其最大吸收波長通常在 532 nm 處，可通過比色法來定量檢測脂質過氧化水平。

此外，4-HNE 抗體可以用來定量檢測 4-HNE 水平。需要注意的是，MDA 和 4-HNE 在除鐵死亡外的多種氧化應激狀態下均可產生，在實際應用中，一般與其他檢測方法進行相互驗證，以提高結果的可靠性和準確性[10]。

 
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02
鐵代謝相關生物標志物檢測[23]

在鐵死亡過程中，細胞內 Fe2+的積累會導致氧化應激的增加，從而促進脂質過氧化。因此，細胞鐵含量或者 Fe2+/Fe3+ 比值的測定可作為鐵死亡監測的重要指標。FerroOrange 是一種特異性 Fe2+ 探針，可與 Fe2+ 結合形成橙紅色熒光復合物。通過熒光顯微鏡或流式細胞術檢測 （Ex/Em: 542/572 nm），可以實現定量分析細胞內 Fe2+ 的濃度。
 
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03
谷胱甘肽代謝相關生物標志物檢測

谷胱甘肽（GSH）是細胞內主要的抗氧化。在鐵死亡過程中，GSH 水平顯著下降，可導致細胞抗氧化能力減弱，進而促進脂質過氧化物的積累。因此，檢測 GSH 相關代謝等指標可用于監測鐵死亡的過程。

3.1 GSH 含量檢測[24]

比色法，熒光探針法，ELISA，HPLC 和質譜等方法都可以用來檢測 GSH 含量。例如，GSH/GSSG Assay Kit是一種基于二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法的 GSH 含量檢測試劑盒，DTNB 能夠與還原型 GSH 發生特異性反應形成一種黃色的化合物⸺硫代二硝基苯酮（TNB），同時釋放出氧化型 GSH（GSSG）。生成的 TNB 在 405 nm 波長下具有強吸收，可以通過比色法測定。

此外，Monochlorobimane 等 GSH 熒光探針也可用來檢測 GSH 含量變化。
 
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3.2 胱氨酸攝取活性檢測[26]

System xc-以 1:1 的比例用胞內谷氨酸來換取胞外胱氨酸（Cys2）的輸入，隨后被還原為為半胱氨酸（Cys）。抑制System xc-的活性會抑制胱氨酸的吸收，影響 GSH 的合成，導致 GPX4 活性降低，促進鐵死亡。因此，胱氨酸攝取活性可作為表征 System xc- 活性的檢測指標，可通過 Cys 探針檢測胞內 Cys 含量。

04
細胞和亞細胞水平的形態學檢測

4.1 細胞形態

鐵死亡細胞的典型形態學特征包括質膜完整性喪失、細胞膜破裂、線粒體萎縮、線粒體外膜破裂、嵴減少或缺失和膜密度增加（Figure 9），可通過透射電子顯微鏡（TEM）檢測。TEM 的主要缺點是：樣本制備過程繁瑣，需要進行脫水、包埋和切片等步驟，可能導致細胞形態的改變，從而影響觀察結果。

電鏡分析方法參考[27]
1. 樣品固定：用 2% 戊二醛（0.1 M 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）固定細胞。
2. 脫水并包埋：2% OsO4 固定細胞切片后，用乙醇脫水，包埋在 Epok 812 中。
3. 切片染色：使用超微切片機切割后，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，以增強對比度。
4. 觀察記錄：將染色后的切片放入 TEM 中，觀察并記錄線粒體的形態變化。

4.2 亞細胞器變化

鐵死亡發生時，伴隨著線粒體膜通透性增加和線粒體膜電位降低，內質網粘度增加和內質網應激，以及溶酶體鐵或一氧化氮（NO）的累積。可借助相關熒光探針，用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測[28]。
 
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05
調控鐵死亡的基因和蛋白的檢測

鐵死亡主要由鐵依賴性脂質過氧化引起，其調控機制包括多種，主要分為：過氧化代謝部分（如鐵代謝和脂代謝途徑）和抗氧化部分（如 System xc--GSH-GPX4 途徑，AIFM2-CoQ10/GCH1-BH4/ESCRT-III 和 DHODH 途徑）。鐵死亡發生時，一些關鍵基因和蛋白表達水平會發生變化，因此，可采用 Western blot/免疫熒光/免疫組織化學/實時熒光定量 PCR 等技術來表征鐵死亡的發生。
 
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