Light文獻分享——無旁瓣超分辨成像:軸向分辨率突破至26 納米
瀏覽次數(shù):562 發(fā)布日期:2025-6-23
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在微觀世界的觀測中,超分辨率成像技術(shù)始終致力于突破光的衍射極限,為人類揭開納米尺度的奧秘。華南師范大學詹求強團隊提出了一種名為UNEx-4Pi的超分辨率成像技術(shù)。該技術(shù)通過融合光子雪崩納米顆粒的超高非線性激發(fā)(UNEx)與基于鏡子的雙焦矢量場調(diào)制(4Pi),首次在真實物理空間中實現(xiàn)了無旁瓣的三維納米級成像,軸向分辨率達到λ/33(26納米),較傳統(tǒng)激光掃描顯微鏡(LSM)提升近50倍。這一突破不僅解決了傳統(tǒng)4Pi顯微術(shù)旁瓣干擾與系統(tǒng)復(fù)雜的難題,更為生物醫(yī)學、納米光刻等領(lǐng)域提供了全新的技術(shù)路徑。
該研究由潘斌雄、王保菊、詹求強等學者共同完成,相關(guān)成果以“Sidelobe-free deterministic 3D nanoscopy with λ/33 axial resolution”為題,于2025年發(fā)表在國際頂級光學期刊《Light:Science&Applications》上。
重要發(fā)現(xiàn)
01非線性激發(fā)與光學干涉的協(xié)同突破
UNEx-4Pi技術(shù)的底層邏輯源于對“光學非線性效應(yīng)”的極致利用。傳統(tǒng)4Pi顯微術(shù)通過雙物鏡干涉壓縮軸向點擴散函數(shù)(PSF),但固有旁瓣強度可達主峰值的60%,嚴重影響成像質(zhì)量。而UNEx-4Pi引入鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆粒(如Yb³⁺/Pr³⁺共摻雜納米顆粒),其光子雪崩效應(yīng)可產(chǎn)生高達35階的光學非線性響應(yīng)。理論模擬顯示,當非線性階數(shù)N>10時,4Pi干涉場的旁瓣強度可被抑制至主峰值的0.1%以下,且軸向分辨率公式從傳統(tǒng)的dz≈λ/3n優(yōu)化為dz≈λ/3n√N,即非線性階數(shù)越高,分辨率提升越顯著。實驗中,團隊采用852nm連續(xù)激光激發(fā)18nm的PA納米顆粒,通過鏡面輔助的單物鏡雙焦自干涉策略,成功獲得了軸向26nm、橫向53nm的超分辨率聚焦斑,且在觀測范圍內(nèi)完全消除了旁瓣。這一結(jié)果打破了傳統(tǒng)認知——無需復(fù)雜的數(shù)學反卷積算法,僅通過物理機制即可實現(xiàn)“旁瓣清零”。
02從納米顆粒到細胞結(jié)構(gòu)的精準解析
在3D超分辨率生物成像實驗中,UNEx-4Pi展現(xiàn)出卓越的光學切片能力。當對分布于鏡面上的PA納米顆粒進行成像時,傳統(tǒng)LSM因衍射極限限制,無法分辨間距100nm的顆粒;4Pi顯微術(shù)雖壓縮了軸向PSF,但旁瓣導致圖像模糊;而UNEx-4Pi不僅清晰分辨出相鄰顆粒,其軸向分辨率經(jīng)實測達26nm,較LSM的1277nm提升近50倍。進一步對BSC-1細胞的核膜進行標記成像時,UNEx-4Pi在軸向32nm分辨率下,無需后期處理即可清晰呈現(xiàn)核膜的精細結(jié)構(gòu),而傳統(tǒng)4Pi與低階非線性技術(shù)則因旁瓣殘留或分辨率不足,無法分辨亞100nm的細節(jié)。這種“即拍即得”的超分辨率能力,得益于PA納米顆粒的抗光漂白特性與UNEx-4Pi的低光毒性設(shè)計,實驗中連續(xù)兩小時的活細胞成像未觀察到明顯光損傷。
03從雙物鏡到單鏡單光束的極簡升級
傳統(tǒng)4Pi顯微術(shù)依賴雙物鏡與多光路精準對齊,不僅硬件成本高昂,還需hourly校準。UNEx-4Pi通過“鏡面反射替代雙物鏡”的設(shè)計,將系統(tǒng)簡化為“單物鏡+SLM相位調(diào)制+鏡面”的結(jié)構(gòu),利用空間光調(diào)制器(SLM)生成雙焦相位圖案,經(jīng)鏡面反射后形成干涉場,等效于傳統(tǒng)4Pi的雙物鏡聚焦效果。這種設(shè)計帶來了驚人的穩(wěn)定性,當焦點偏差達1個波長(850nm)時,傳統(tǒng)4Pi的旁瓣強度會升至主峰值的80%,而UNEx-4Pi因超高非線性效應(yīng),仍能維持旁瓣強度<0.1%。實驗驗證其軸向動態(tài)掃描范圍達12μm,足以覆蓋貼壁生長的哺乳動物細胞,且無需軸向移動樣本臺,僅通過改變SLM圖案即可實現(xiàn)3D成像,大幅提升了系統(tǒng)實用性。
創(chuàng)新與亮點
01旁瓣消除的物理革命
首次在真實空間中通過純物理手段(而非算法)根除4Pi顯微術(shù)的旁瓣難題。傳統(tǒng)技術(shù)中,即使結(jié)合雙光子激發(fā)(2PE),旁瓣高度仍達5%,而UNEx-4Pi利用35階非線性效應(yīng),將旁瓣壓制至“零觀測”水平,從根本上解決了成像對比度與光漂白問題。
02系統(tǒng)復(fù)雜度的斷崖式降低
相較于isoSTED需六束激光+雙物鏡的復(fù)雜配置,UNEx-4Pi僅用單物鏡、單束低功率連續(xù)激光(852nm CW)與一面反射鏡,硬件成本降低60%以上,且無需頻繁校準,系統(tǒng)穩(wěn)定性提升10倍以上。
03分辨率與實用性的雙重躍升
軸向λ/33(26nm)的分辨率不僅超越了現(xiàn)有單物鏡技術(shù),其“低功率+抗光漂白”特性更適用于活細胞長期監(jiān)測。例如,在BSC-1細胞成像中,UNEx-4Pi以100μs/像素的掃描速度,實現(xiàn)了核膜結(jié)構(gòu)的動態(tài)捕捉,而傳統(tǒng)MINFLUX等技術(shù)因依賴高強度激光,難以完成類似觀測。
總結(jié)與展望
UNEx-4Pi以“非線性光學+矢量場調(diào)制”的創(chuàng)新思路,重新定義了超分辨率成像的技術(shù)邊界。從科學價值看,它首次證明了通過光學非線性效應(yīng)可在遠場實現(xiàn)物理空間的無旁瓣聚焦,為研究光與物質(zhì)的納米級相互作用提供了“精準探針”;從應(yīng)用層面,其單光束、低光毒性的特性,使其在活細胞動態(tài)追蹤、單分子定位等領(lǐng)域極具潛力——例如,文中展示的核膜32nm軸向分辨率,已能滿足染色質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的需求。未來,UNEx-4Pi的發(fā)展將聚焦兩大方向,一是集成自適應(yīng)光學技術(shù),克服樣本厚度帶來的像差,將成像深度從當前的12μm擴展至100μm以上,以適應(yīng)組織級三維成像;二是開發(fā)更快響應(yīng)的光子雪崩材料,將掃描速度提升至毫秒級,實現(xiàn)細胞器動態(tài)過程的實時記錄。此外,其超高非線性聚焦特性還可延伸至納米光刻、光存儲等領(lǐng)域,例如基于λ/33的聚焦精度,有望實現(xiàn)亞50nm的3D光刻線條,為下一代芯片制造提供技術(shù)儲備。這項技術(shù)不僅是超分辨率成像的一次突破,更可能成為連接光學基礎(chǔ)研究與納米技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵橋梁。
論文信息
聲明:本文僅用作學術(shù)目的。
Pan B, Wang B, Ni Y, Zhao Q, Wang Y, Cai Y, Zhan Q. Sidelobe-free deterministic 3D nanoscopy with λ/33 axial resolution. Light Sci Appl. 2025 Apr 21;14(1):168.
DOI:10.1038/s41377-025-01833-x.