豬瘟病毒E0蛋白(CSFV-E0)特性與制備技術解析
瀏覽次數:35 發布日期:2025-6-22
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一、CSFV-E0 蛋白的分子特性
1.
分子量與結構特征
- 基礎參數:
- 分子量:約 14-18 kDa(因糖基化程度不同存在差異),由 140-160 個氨基酸組成。
- 結構特點:
- 含 3 個保守的半胱氨酸殘基(Cys),形成分子內二硫鍵,維持折疊構象;
- N 端含信號肽(約 20 個氨基酸),C 端含疏水區,參與病毒包膜形成;
- 糖基化位點:Asn-40、Asn-100(N - 糖基化),糖鏈修飾后分子量可增加 2-4 kDa。
2.
抗原性與功能定位
- 抗原表位:
- 線性表位:氨基酸殘基 50-65(中和抗體結合區)、90-105(型特異性表位);
- 構象表位:依賴二硫鍵的折疊區域(如 Cys-45 與 Cys-110 形成的環區)。
- 生物學功能:
- 參與病毒與宿主細胞的黏附,介導病毒包膜與內體膜的融合;
- 具有核糖核酸酶(RNase)活性,可降解宿主細胞 RNA,抑制干擾素產生。
二、CSFV-E0 蛋白的表達系統選擇
表達系統 |
技術特點 |
優勢 |
局限性 |
原核表達(E. coli) |
- 載體:pET-32a(帶 His 標簽),IPTG 誘導(1 mM,37℃ 4 h)
- 表達形式:包涵體(需變性復性) |
成本低、產量高(50-100 mg/L),適合抗原制備 |
缺乏糖基化,構象表位丟失,需復性后活性驗證 |
酵母表達(P. pastoris) |
- 載體:pPICZαA,甲醇誘導(0.5% v/v,28℃ 72 h)
- 表達形式:分泌型(胞外培養基) |
具備糖基化(低等修飾),可溶性好,純化簡單 |
糖鏈結構與天然蛋白差異大,產量約 10-30 mg/L |
昆蟲細胞(Sf9) |
- 載體:桿狀病毒表達系統(Bac-to-Bac),Sf9 細胞感染(MOI=5,27℃ 72 h)
- 表達形式:膜結合型 / 分泌型 |
糖基化接近哺乳動物細胞,天然構象保留率高 |
操作復雜,成本較高,產量 20-50 mg/L |
哺乳動物細胞(HEK293) |
- 載體:pCDNA3.1,脂質體轉染(48 h 后收集上清)
- 表達形式:分泌型(需信號肽引導) |
糖基化修飾完整,活性接近天然蛋白,適合功能研究 |
表達量低(5-10 mg/L),培養成本高 |
三、CSFV-E0 蛋白的純化系統與工藝
1.
原核表達純化(以包涵體為例)
- 流程:
- 菌體破碎:超聲破碎(功率 300 W,工作 3 s / 間隔 3 s,共 10 min),4℃ 12,000×g 離心 20 min 收集包涵體;
- 變性溶解:8 M 尿素 + 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)+10 mM DTT,室溫攪拌 2 h,12,000×g 離心 30 min 取上清;
- 親和層析:Ni-NTA 柱(平衡液:8 M 尿素 + 50 mM NaH₂PO₄+300 mM NaCl,pH 8.0),洗脫液:500 mM 咪唑,收集洗脫峰;
- 復性:梯度透析(8 M→4 M→2 M→0 M 尿素,含 1 mM 氧化型谷胱甘肽 / 10 mM 還原型谷胱甘肽),4℃過夜,最終用 PBS(pH 7.4)透析換液。
2.
真核表達純化(以昆蟲細胞為例)
- 流程:
- 培養基收集:感染后 72 h 離心(4℃ 5,000×g 15 min)去除細胞碎片;
- 親和層析:Protein A/G 柱(適用于 IgG 融合蛋白)或 Ni-NTA 柱(帶 His 標簽),平衡液:PBS(pH 7.4),洗脫液:100 mM 檸檬酸(pH 3.0),立即用 1 M Tris-HCl(pH 9.0)中和;
- 凝膠過濾:Superdex 75 柱(PBS 平衡),分離純化單體蛋白,去除多聚體或降解產物。
四、CSFV-E0 蛋白的電泳分析方法
1.
SDS-PAGE 檢測
- 條件:
- 凝膠濃度:12-15% 分離膠(小分子蛋白優化分辨率),5% 濃縮膠;
- 上樣量:純化蛋白 5-10 μg,還原條件(含 5% β- 巰基乙醇)與非還原條件對比;
- 結果:
- 原核表達:非糖基化條帶約 14 kDa,還原后單一條帶;
- 真核表達:糖基化條帶 16-18 kDa,非還原條件下可能因二硫鍵形成二聚體(約 30-35 kDa)。
2.
Western blot 驗證
- 探針:
- 一抗:抗 CSFV-E0 多克隆抗體(1:1,000 稀釋)或單克隆抗體(1:500);
- 二抗:HRP 標記羊抗鼠 IgG(1:5,000),DAB 顯色或化學發光(ECL)檢測。
- 注意:真核表達蛋白需驗證糖基化位點(如用 PNGase F 酶處理后電泳,條帶分子量降低 2-4 kDa)。
五、CSFV-E0 蛋白表達與純化的關鍵優化點
- 表達系統選擇策略
- 診斷抗原:優先原核表達(成本低),需通過復性獲得可溶性蛋白,并用 ELISA 驗證抗體結合活性;
- 疫苗研發:昆蟲細胞或哺乳動物細胞表達(保留糖基化),確保免疫原性,動物實驗需驗證中和抗體效價。
- 純化工藝優化
- 原核表達:復性時添加 10% 甘油可提高蛋白折疊效率,降低聚集;
- 真核表達:培養基中添加 10 mM MgCl₂可增強 E0 蛋白的 RNase 活性,用于功能研究。
- 質量控制指標
- 純度:SDS-PAGE 考馬斯亮藍染色顯示單一條帶,純度≥95%(ImageJ 分析);
- 活性:RNase 活性檢測(降解 polyU RNA,紫外吸收法測定 OD260nm 變化);
- 內毒素:LAL 法檢測≤1 EU/μg(用于疫苗或細胞實驗)。
六、CSFV-E0 蛋白的應用場景
- 診斷試劑:作為包被抗原用于 ELISA 檢測豬血清中的抗 CSFV 抗體(如 cELISA,特異性>98%);
- 疫苗研發:亞單位疫苗組分(與 E2 蛋白聯合),誘導中和抗體和細胞免疫;
- 抗病毒藥物篩選:基于 E0 蛋白的 RNase 活性建立抑制劑篩選模型(如熒光底物法);
- 基礎研究:探究 E0 蛋白與宿主細胞受體(如 CD46)的相互作用機制(Co-IP 或 SPR 技術)。
七、生物安全與操作注意事項
- 涉及 CSFV 活病毒的實驗需在 BSL-2 實驗室進行,重組蛋白表達需驗證無病毒核酸污染(RT-PCR 檢測);
- 純化過程中若使用變性劑(如尿素),需在后續應用中徹底去除(透析或層析換液),避免影響抗體結合或細胞實驗。