抗豬瘟病毒(CSFV)單克隆抗體的制備及應用場景
瀏覽次數:220 發(fā)布日期:2025-6-19
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一、基本概念
抗豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)單克隆抗體(Monoclonal Antibody, mAb)是通過雜交瘤技術制備的,能特異性識別 CSFV 表面抗原表位的單一抗體分子,具有高度特異性和均一性,在豬瘟診斷、病毒研究及相關生物制品開發(fā)中具有重要應用價值。
二、制備流程
(一)抗原制備
- CSFV 毒株選擇:常用強毒株(如石門株)或疫苗株(如 C 株),在易感細胞(如豬腎細胞 PK-15、豬睪丸細胞 ST 等)中培養(yǎng)增殖,通過滅活(甲醛或 β- 丙內酯)或純化處理獲得抗原。
- 抗原純化:采用蔗糖密度梯度離心、親和層析等方法純化病毒粒子,確保抗原純度,減少非特異性反應。
(二)動物免疫
- 免疫動物:通常選擇 6-8 周齡 Balb/c 小鼠,通過腹腔注射 CSFV 抗原(輔以弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑),免疫周期約 4-6 周,末次免疫后 3-5 天取脾臟制備脾細胞。
(三)雜交瘤細胞制備
- 細胞融合:將脾細胞與骨髓瘤細胞(如 SP2/0、NS0)按比例(通常 3:1-10:1)混合,使用聚乙二醇(PEG)或電融合法誘導融合。
- 篩選與克隆:融合細胞接種于 HAT 培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)篩選,通過間接 ELISA 法篩選能分泌抗 CSFV 抗體的雜交瘤細胞,再經有限稀釋法克隆化,獲得單克隆細胞株。
(四)抗體生產與純化
- 體內誘生法:將雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔,收集腹水,通過辛酸 - 硫酸銨沉淀、Protein A/G 親和層析等方法純化抗體。
- 體外培養(yǎng)法:在無血清培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞,離心收集上清液,經純化獲得抗體。
三、關鍵特性參數
(一)免疫學特性
- 特異性:能特異性識別 CSFV 的結構蛋白(如 E2 糖蛋白,主要抗原表位所在區(qū)域),與其他豬病毒(如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等)無交叉反應。
- 親和力:親和力常數(KD)通常在 10⁻⁸-10⁻¹² M 之間,高親和力抗體可提高診斷靈敏度。
- 中和活性:部分單克隆抗體具有中和病毒感染的能力,可用于中和試驗(VNT),評估抗體對 CSFV 的抑制效果。
(二)分子生物學特性
- 抗體類型:小鼠源單克隆抗體多為 IgG1、IgG2a 等亞型,輕鏈為 κ 或 λ 型,可通過亞型鑒定試劑盒確定。
- 分子量:完整抗體分子約 150 kDa(重鏈 50 kDa + 輕鏈 25 kDa×2),若為單鏈抗體(scFv)則分子量約 25-30 kDa。
(三)應用相關參數
- 效價:腹水抗體效價通?蛇_ 1×10⁵-1×10⁶(ELISA 法測定),細胞培養(yǎng)上清效價約 1×10³-1×10⁴。
- 靈敏度與檢測限:在 ELISA 檢測中,對 CSFV 的最低檢測限可達 ng/mL 級,具體取決于抗體與抗原的結合效率及檢測方法優(yōu)化。
- 穩(wěn)定性:純化抗體在 4℃可保存數月,-20℃凍存可穩(wěn)定數年,避免反復凍融。
四、主要應用場景
- 診斷檢測:
- 用于 ELISA、免疫熒光(IFA)、膠體金試紙條等方法,檢測豬血清、組織液中的 CSFV 抗原或抗體。
- 作為標準品或質控品,校準診斷試劑盒的準確性。
- 病毒研究:
- 標記 CSFV 蛋白,研究病毒入侵、復制及組裝機制。
- 篩選病毒中和表位,輔助疫苗設計(如亞單位疫苗開發(fā))。
- 生物制品開發(fā):
- 制備雙抗體夾心 ELISA 試劑盒,提高豬瘟檢測的特異性和靈敏度。
- 與抗病毒藥物聯(lián)用,探索抗體 - 藥物偶聯(lián)物(ADC)在豬瘟治療中的潛力(實驗階段)。
五、制備難點與優(yōu)化方向
- 難點:CSFV 抗原表位易變異,可能導致單克隆抗體對不同毒株的識別能力差異;部分高親和力抗體可能因表位遮擋,中和活性有限。
- 優(yōu)化方向:
- 采用多株單克隆抗體混合(雞尾酒療法),覆蓋病毒不同抗原表位,提高廣譜性。
- 通過基因工程技術(如抗體人源化、噬菌體展示技術)改造小鼠抗體,降低免疫原性,提升臨床應用潛力(如被動免疫治療)。
六、典型案例參考
- 抗 CSFV E2 蛋白單克隆抗體:針對 E2 糖蛋白的單克隆抗體(如 3H4、2G10 等株)是目前豬瘟診斷的常用工具,可識別 E2 蛋白上的線性或構象表位,在病毒中和及抗原檢測中表現(xiàn)出高特異性。
- 中和性單克隆抗體篩選:通過病毒中和試驗篩選出的 mAb,可用于評估 CSFV 毒株的致病性,或作為中和活性標準品用于疫苗效力評價。