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超聲法與酶切法在二代測序文庫構建中的應用

瀏覽次數:675 發布日期:2025-3-19  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
超聲法
機械法片段化以非偏倚的方式控制片段大小,無GC偏好性。但在打斷過程中,DNA溶液的物理散射常常導致DNA樣本的丟失。因此,當投入的DNA量為皮克級時,不建議使用機械法進行打斷。
對于dsDNA片段化,超聲打斷堪稱一代宗師。打斷的DNA片段更為集中且無偏好性,是目前NGS建庫中片段化的金標準。
深圳達遠辰光科技有限公司提供的聚焦超聲樣品處理系統,使用高頻聚焦超聲波將能量集中于DNA樣品,整個過程溫度可控,無樣本接觸,提供了快速、標準的DNA片段化結果。
酶法
酶切法打斷是利用片段化酶對基因組DNA進行隨機打斷,會有GC偏好性(富含GC堿基的核酸片段區域比較不容易打斷),在后續的測序分析會產生更多的錯誤信息。
缺點:
1 容易產生假陽性突變
根據研究表明,相對于機械打斷法,酶法構建的文庫中產生了更多的SNV(單核苷酸位點變異)/indels(插入缺失)。

圖1 本文研究對使用超聲和酶解片段化方法制備的相同腫瘤DNA樣品的體細胞變異進行了比較,分析結果顯示,與通過超聲處理產生的文庫相比,酶切法處理的文庫中反復出現的人為引入的SNV(單核苷酸位點變異)/indels(插入缺失)數量要多2-9倍。
2 不穩定的文庫產出
通過酶切時間靈活控制片段大小在 150-600 bp 之間,以適配不同的應用場景。然而,在實際使用中,對于測序讀長模式相對固定(PE150)的靶向捕獲應用而言卻是一種負擔。尤其是當樣本數量不固定時,精確控制“分鐘級別”酶切時間,獲得均一的文庫產出并不容易實現。特別是對于FFPE樣本,該類樣本常伴隨不同程度的降解,很難用統一的酶切條件處理。
3 GC偏好性
可能存在GC 含量輕度升高的情況(片段化酶更加容易酶切AT)
 
表1 不同片段化方法的優缺點
  機械法 酶切法
優勢
  • 易于獲得大小合適的片段
  • 無專用設備及耗材
  • 無偏好性
  • 易于自動化
  • 無酶和化學離子干擾
  • 樣本投入量要求更低
  • 二代測序結果金標準
 
劣勢
  • 需專用設備
  • 有一定的偏好性
  • 樣本量要求相對更高
  • 樣本質量要求更高
  • 核酸量損耗
  • 容易產生假陽性突變
 
在實際操作中,用戶會根據樣本的初始量、實驗的特異性需求以及實驗成本等因素來選擇片段化方法。
超聲法:全基因組測序、全外顯子測序、甲基化測序、ChIP-seq
酶切法:全基因組測序、全外顯子測序、宏基因組測序(mNGS)
發布者:深圳達遠辰光科技有限公司
聯系電話:0755-86727654
E-mail:marketing@longlightech.com

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