介紹

這篇博客文章的目的是為Simoa®用戶提供有效的資源，用于檢測下限（LOD）和定量下限（LLOQ）的常見分析驗證。確定檢測和定量下限的方法在復雜性上有所不同，這取決于測定開發階段和適用的法規。例如，在早期開發中，通過簡單地插值校準曲線來近似LOD可能就足夠了，但對于最終驗證，可能需要使用真實樣本進行更深入的實驗和統計方法。

指導方針

臨床和實驗室標準研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）專門為診斷免疫測定驗證提供了一些最具參考價值的指南。這些指南發表在一系列文件中，如CLSI EP17——臨床實驗室測量程序檢測能力評估，第2版。除了CLSI指南外，歐洲藥品管理局在其ICH Q2（R2）分析程序驗證——科學指南文件中提供了另一套有價值的指南，用于驗證各種分析方法，不限于免疫測定。本指南主要側重于藥品質量控制中使用的分析方法。

檢測極限和定量極限的估計

CLSI指南使用三種檢測質量屬性來接近檢測能力：空白限度（Limit of Blank LOB）、檢測限度（Limit of Detection LOD）和定量限度（ Limit of Quantitation LOQ）。

LOB：當對不含分析物的樣品進行重復測試時，預計會發現的最高表觀分析物濃度。

LOD：可與LOB可靠區分的最低分析物濃度，在該濃度下檢測是可行的。

LOQ：分析物不僅可以可靠檢測，而且可以達到某些預定義目標（即精度和偏差）的最低濃度。

高靈敏度測定的特征在于低LOD；然而，低LOB也是實現低LOD所必需的。在任何免疫測定中，由于非特異性結合（例如，檢測抗體與捕獲表面和/或抗體之間的弱相互作用），都會有固有的背景信號，但可以采取步驟將其最小化。在Simoa®開發Homebrew時，我們通常建議將空白信號的目標定為每珠平均酶數0.005–0.05（AEB）。然而，了解空白樣品和低濃度樣品的可變性是評估測定檢測能力的關鍵。根據CLSI EP17指南，含有LOD分析物的樣品應在95%的時間內與LOB區分開來。

設計實驗以評估檢測限時要考慮的變量包括要測試的試劑盒批次數量、操作員數量（如果使用手動步驟的儀器，如SR-X）、天數（分析批間變異性）、要測試的不同空白樣品/低濃度樣品數量，以及要測試的空白/低濃度樣本的總重復次數。根據定義，LLOQ必須等于或大于LOD。LLOQ的確定與LOD的不同之處在于，還需要滿足精度和偏差的預定義目標。通常，精密度的目標是將產生20%或更低的濃度變異系數（CV）的最低分析物濃度。可以使用各種方法來確定LLOQ，Quanterix使用的三種方法在客戶門戶網站上的技術說明中有描述（TECH-0034；定量下限）。4PL方法開發工具（也在客戶門戶網站上）使用一種稱為CV分析的方法，根據校準曲線數據估計LLOQ。電子表格不是為用戶設計的驗證工具（因此計算是隱藏/鎖定的），但它可以是早期分析開發中的有用工具，也可以用來表征正在開發或測試的分析的性能。