標記和修飾抗體的蛋白質交聯新方法Buccutite共軛法研究
簡 介
兩個大生物分子間的共價結合，是研究人員的一項重要任務，例如酶的抗體或DNA的酶。有多種可用于交聯兩種生物分子的方法，其中最常見的方法，就是使用小交聯劑（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反應的NHS脂與蛋白質的游離胺（-NH2）反應，另一端具有巰基反應的馬來酰亞胺基與生物分子的巰基（-SH）反應。SMCC修飾的蛋白質接頭是非常不穩定的，通常是自反應的，因為蛋白質通常含有游離胺和巰基，導致大量的同位交聯。另外，蛋白質上馬來酰亞胺基團數目的定量是繁瑣的，而且很難確定兩個生物分子在反應中聯接的合適的摩爾比以達到理想的功能和偶聯效率。
現在，有一種簡單有效的交聯方法，將兩個高共軛率的生物分子連接起來。該方法使用兩種獨特的交聯劑（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交聯劑易于控制和量化。經過脫鹽柱去除游離連接物后，Buccutite MAT激活的抗體和Buccutite FOL修飾的蛋白質在溫和條件下混合后易發生反應。從本質上講，這種純化是不必要的，而且在反應中沒有同位交聯的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交聯方法
材料和方法
抗體和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG來自Jacksonm免疫研究實驗室，HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies.
凈化柱：所有的凈化柱都來自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
細胞成像：Hela細胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG綴合物染色。用Olympus IX71熒光顯微鏡成像。
共軛原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小時）修飾標簽蛋白（APC或PE）。
2.用旋轉柱（5min）對激活的lgG5和修飾的標記蛋白進行純化。
3.將活化的抗體和修飾的標記蛋白混合30分鐘。
4.用所需的共軛物染色細胞，無需純化。
抗體蛋白質結合過程
結 果
用于ELISA檢測的HRP-lgG共軛物
用Buccutite交聯技術（紅色）和SMCC方法（藍色）制備HPR-山羊-抗小鼠lgG共軛物，產生直接ELISA曲線。將小鼠單克隆抗體（100ng）包被在96孔板上，用標準方法將GAM lgG-HRP共軛物稀釋為2倍稀釋系列。使用ABTS底物溶液（#11001）檢測30分鐘并在405nm讀取的固定化小鼠lgG.
用于細胞成像的lgG-RPE共軛物
在Hela細胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物對微管蛋白進行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗體對微管蛋白進行染色，并如上所述用Buccutite交聯技術制備的紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物顯現。
結 論
1.連接器非常穩定。Buccutite接頭激活的大分子非常穩定，可以在4℃下儲存超過24個月。
2.共軛條件是非常溫和和強大的。Buccutite結合物可以在PH、濃度和溫度范圍內運行，不需要催化劑。
3.高效率：Buccutite共軛可在1小時內完成。在相同條件下，Buccutite共軛法比其他現有的方法具有更高的產率，共軛可以在極低的濃度下進行。
兩個大生物分子間的共價結合，是研究人員的一項重要任務，例如酶的抗體或DNA的酶。有多種可用于交聯兩種生物分子的方法，其中最常見的方法，就是使用小交聯劑（如磺化SMCC）。SMCC一端具有胺反應的NHS脂與蛋白質的游離胺（-NH2）反應，另一端具有巰基反應的馬來酰亞胺基與生物分子的巰基（-SH）反應。SMCC修飾的蛋白質接頭是非常不穩定的，通常是自反應的，因為蛋白質通常含有游離胺和巰基，導致大量的同位交聯。另外，蛋白質上馬來酰亞胺基團數目的定量是繁瑣的，而且很難確定兩個生物分子在反應中聯接的合適的摩爾比以達到理想的功能和偶聯效率。
現在，有一種簡單有效的交聯方法，將兩個高共軛率的生物分子連接起來。該方法使用兩種獨特的交聯劑（Buccutite MAT和Buccutite FOL）。MAT和FOL蛋白的交聯劑易于控制和量化。經過脫鹽柱去除游離連接物后，Buccutite MAT激活的抗體和Buccutite FOL修飾的蛋白質在溫和條件下混合后易發生反應。從本質上講，這種純化是不必要的，而且在反應中沒有同位交聯的生物分子。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交聯方法
材料和方法
抗體和酶：山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG來自Jacksonm免疫研究實驗室，HRP來自Calzyme，微管蛋白小鼠mAb來自Life Technologies.
凈化柱：所有的凈化柱都來自Bio-Rad的Bio-Spin尺寸排除柱。
細胞成像：Hela細胞用4%甲醛固定，用小鼠抗微管蛋白染色，然后用HPR-Goat-Anti-Mouse lgG綴合物染色。用Olympus IX71熒光顯微鏡成像。
共軛原理
1.用MAT激活山羊抗小鼠lgG，用FOL（1小時）修飾標簽蛋白（APC或PE）。
2.用旋轉柱（5min）對激活的lgG5和修飾的標記蛋白進行純化。
3.將活化的抗體和修飾的標記蛋白混合30分鐘。
4.用所需的共軛物染色細胞，無需純化。
抗體蛋白質結合過程
結 果
用于ELISA檢測的HRP-lgG共軛物
用Buccutite交聯技術（紅色）和SMCC方法（藍色）制備HPR-山羊-抗小鼠lgG共軛物，產生直接ELISA曲線。將小鼠單克隆抗體（100ng）包被在96孔板上，用標準方法將GAM lgG-HRP共軛物稀釋為2倍稀釋系列。使用ABTS底物溶液（#11001）檢測30分鐘并在405nm讀取的固定化小鼠lgG.
用于細胞成像的lgG-RPE共軛物
在Hela細胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物對微管蛋白進行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗體對微管蛋白進行染色，并如上所述用Buccutite交聯技術制備的紅色熒光RPE-山羊-抗小鼠lgG共軛物顯現。
結 論
1.連接器非常穩定。Buccutite接頭激活的大分子非常穩定，可以在4℃下儲存超過24個月。
2.共軛條件是非常溫和和強大的。Buccutite結合物可以在PH、濃度和溫度范圍內運行，不需要催化劑。
3.高效率：Buccutite共軛可在1小時內完成。在相同條件下，Buccutite共軛法比其他現有的方法具有更高的產率，共軛可以在極低的濃度下進行。
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