哺乳動物細胞培養物中氧氣和pH的實時測量對于了解細胞培養物的代謝動力學非常重要。SDR SensorDish Reader® 可根據環境條件或毒理學損傷，跟蹤細胞耗氧量的時間過程。這種類型的監測對組織工程和干細胞研究等其他應用也有價值。

圖 1：用于在線監測24孔多培養皿中溶解氧和pH值的SDR SensorDish® Reader

SDR SensorDish® Reader（圖1）可對24孔微量滴定板中的氧氣和pH值進行非侵入式在線監測。在本研究中，SDR用于監測以4種不同細胞密度和不同氧張力（19%O2（圖2）和7%O2（圖3））。此外，還評估了線粒體調節劑對氧氣消耗率的影響(圖4)。以小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）為代表性哺乳動物細胞類型，以羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）為代謝解偶聯劑，抗霉素為電子傳遞鏈抑制劑。

一、材料與方法

小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）細胞在具有集成氧傳感器（OxoDishes®）的24孔多培養皿中生長。在標準細胞培養條件（5%CO2、35%濕度和37°C）下，將細胞維持在有10%熱滅活胎牛血清（FBS）、1%青霉素（10000 U/ml）/鏈霉素（10000µg/ml）、1%L-谷氨酰胺（200mM）、1%非必需氨基酸（10mM）和1%1M HEPES（pH 7.8）的Dulbeco改良的Eagle培養基（DMEM）中。在所有情況下，細胞在Coy O2控制手套箱中的1ml培養基/孔中生長。在整個培養期間，使用SensorDish®Reader軟件按預設間隔監測培養基中的氧濃度。

二、細胞密度的影響

第一個實驗旨在研究細胞密度對細胞耗氧率和隨后培養基中pO2水平的影響。MEF細胞以三種不同的濃度(100,000;33,000;和10,000個細胞/cm2)以及“僅介質”控制。在接近大氣中的氧氣水平(約為19% O2)下，每2分鐘測量一次，持續10小時。氧分布(圖2)清楚地顯示了細胞密度對每個處理的氧消耗水平的影響。觀察到的滯后時間< 1小時，推測系統正在與溫度和氧氣水平平衡。在此之后，所有細胞濃度都顯示出與“僅培養基”對照孔相比pO2水平的下降。最后，在孵育過程中，與“僅培養基”控制孔的偏差與最初接種的細胞數量成正比，這意味著個體細胞呼吸在所有測試的細胞密度下都是等效的。

圖2：不同密度MEF細胞培養液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0細胞/cm2)，并暴露于約19% O2;每組N = 3

第二個實驗旨在研究低氧環境對第一個實驗中細胞密度誘導觀察的影響。MEF細胞以三種不同的濃度(100,000;33,000和10,000細胞/cm2)以及“僅培養基”控制，然后放置在7% O2的環境中，每5分鐘監測一次，持續10小時。氧氣分布證實了細胞密度對每次處理的氧氣消耗水平的影響(圖3)。觀察到短時間的溫度平衡(<1小時)，之后培養基中的剩余氧氣被細胞以密度依賴的方式消耗。即使是“僅介質”在10小時后也不能在7% O2的新氧水平下完全平衡。然而，每次處理與“僅培養基”控制孔的偏差與所接種細胞的數量成正比。

圖3：不同密度MEF細胞培養液中pO2的平均水平(100,000;33,000;10,000和0細胞/cm2)，暴露于7%的O2;每組N = 3

三、線粒體調節劑的作用

第三個實驗旨在研究特定線粒體調節劑對細胞耗氧量和隨后培養基中pO2水平的影響。MEF細胞以33,000個/cm2的速度接種，在培養皿上粘附4小時。然后將培養基替換為含有1µl/ml二甲亞砜(DMSO，對照物)的特定培養基;10µM羰基氰化物間氯苯腙(CCCP);或10µM抗霉素。然后在每個孔上加1ml礦物油，在標準培養條件下(5% CO2, 35%濕度，37°C, 19% O2環境)孵育平板，每2分鐘監測一次，持續10小時。氧譜顯示了處理對細胞耗氧量水平的顯著影響(圖4)。從3到4小時時間點的測量表明，在接受有劑量的培養基之前，處理的變化很小。在給藥30分鐘內，兩組之間的耗氧量曲線出現了可觀察到的差異。DMSO對MEF細胞的平均氧含量變化不大。在約17.5% O2的條件下，形成了耗氧和吸氧之間的穩定狀態。抗霉素是電子傳遞鏈絡合物III的抑制劑，可以明顯降低細胞的耗氧速率，使細胞處于比DMSO更高的穩態。最后，CCCP(一種線粒體解偶聯劑)治療導致細胞耗氧量明顯增加。

圖4：抗霉素、DMSO和CCCP作用4小時時MEF細胞培養液中pO2的平均水平;每組N = 4

四、結論

使用SDR SensorDish® Reader，我們監測了哺乳動物細胞培養物中的培養基氧含量，并顯示了細胞密度依賴性耗氧量。在19%O2、7%O2下都能觀察到密度依賴性差異，這是一個更具生理相關性的氧氣水平。另外，不含細胞的細胞培養基在7% O2條件下需要10小時以上才能達到平衡。因此，建議在所需的氧氣水平下對培養基進行預孵育。最后，與對照組相比，CCCP增加了細胞需氧量，而抗霉素則減少了細胞需氧量。SDR SensorDish® Reader可以持續快速地定量介質氧水平，可用于測量細胞需氧量和代謝功能。

實驗來源：

Lynn S. G. and LaPres J. J.
Dept. of Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

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