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小鼠胚胎成纖維細胞3T3-L1培養及經典“雞尾酒”誘導攻略

瀏覽次數:1036 發布日期:2023-10-24  來源:absin

流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰,肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發病率增高,糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病,長期存在可導致各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細胞——小鼠胚胎成纖維細胞(前脂肪細胞)系具有向脂肪細胞分化的特性,被廣泛用于研究糖尿病,肥胖癥等。
 

圖1 3T3-L1細胞形態

 

表1 3T3-L1基礎培養信息

細胞名稱

3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞)

來源

18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎

生長方式

貼壁生長

細胞形態

成纖維細胞樣

培養條件

95%空氣、5%CO2、37℃

推薦營養體系

DMEM(abs9483)+10% NBCS(abs978)+1%P/S(abs9244)

傳代

0.25%Try(abs47014937)消化5-15min 1:3-1:4傳代

凍存液配制

完全培養基+5%DMSO(abs9187)

 

培養小提示:


1)"Never allow culture to become completely confluent”。細胞匯合度達到70-80%時進行傳代;
2)為了避免細胞聚團,在等待細胞消化的過程中,不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細胞。難以消化的細胞可以放置在37℃;
3)正常培養(非脂肪誘導期)出現空泡時,請優先考慮環境壓力。造成壓力的原因包括培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當或培養基的營養物質耗盡;
4)使用胎牛血清可能會造成細胞分化!!!

 

3T3-L1成脂誘導“雞尾酒”策略


圖2 3T3-L1細胞(正常)和3T3-L1成脂分化后(對照)

 

一般認為,細胞的增值和分化呈負相關,細胞開啟分化必先退出分裂增值周期,常用的方法就是讓其生長至融合期,出現接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉化為脂肪酸,然后作為TAGs(甘油三酯)儲存起來的過程。

 

經典“雞尾酒”法中,胰島素樣生長因子(IGF-1)激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導細胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)通過激活cAMP依賴性蛋白激酶途徑增強CCAAT/增強子結合蛋白家族(C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) 表達促進成脂分化、地塞米松促進C/EBPs的表達。

 

3T3-L1經典成脂誘導過程

 

誘導步驟:將融合后的3T3-L1(匯合度100%)細胞從DMEM生長培養基切換到含有0.5mmol/L IBMX(abs817348)、10mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養基中48h。然后將細胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養基中48h,之后每隔一天更換常規新鮮培養基,一般第九天染色。

PS:不同產品活性純度不同,濃度僅供參考,不同誘導方案略有差異,IBMX(abs817348)用DMSO溶解時需要超聲破碎。

 

染色:油紅O儲存液與超純水按3:2稀釋混勻,過濾,避光靜置后酒紅色且無沉淀,現配現用,2h內用完。

用PBS磷酸緩沖液小心漂洗細胞三次,以2mL/孔(六孔板)的劑量加入4%多聚甲醛,室溫固定40min,再用蒸餾水漂洗2次,每孔加入油紅O工作液1mL,常溫染色15min,蒸餾水漂洗至無殘渣,蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。

PS:清洗細胞時動搖要輕柔,防止脂滴脫落,油紅O工作液一定要過濾至無沉淀,否則染色后有殘渣且較難沖洗!!!

 

“雞尾酒”誘導策略進擊版

 

有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導液2(含10mg/mL胰島素的低糖培養基)的作用時間對3T3L1細胞成脂分化率的影響,結果顯示,低糖培養基誘導時成熟脂肪細胞形成率明顯增高,誘導液2作用時間為3d時,成熟脂肪細胞形成率明顯高于其他組。



圖3 不同葡萄糖濃度對3T3-L1細胞成脂肪分化的影響
Figure2 Results of different time points during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells


圖4 誘導劑II作用時間對3T3-L1細胞成脂肪分化的影響



圖5 3T3-L1細胞成脂肪分化過程中不同時間點結果記錄(最優條件下)

 

注:文中圖片來源于網絡,僅供學習參考用

發布者:愛必信(上海)生物科技有限公司
聯系電話:021-38015121
E-mail:info@absin.cn

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