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生物反應器在合成辣椒素的關鍵步驟人工合成香草胺中的應用

瀏覽次數(shù):1633 發(fā)布日期:2023-9-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
Synthetic  Biology

 

辣椒作為一種常見的食品調味料,除直接食用或淺加工外,還可以提取辣椒素作為食品添加劑制作辣味食品。它還具有抗菌、鎮(zhèn)痛和助消化的特性,被廣泛應用在醫(yī)藥領域。
 



辣椒素的化學法合成都是以香草胺和8-甲基-6-壬烯酸作為反應底物利用Schotten−Baumann反應進行的。目前,其前體物質香草胺都是通過貴金屬催化石油化工產(chǎn)品而得到的。然而,這種方法并不符合綠色化工的要求。



石河子大學化學化工學院張根林教授團隊在ACS Sustainable Chemistry & Engineering上發(fā)表了最新的研究成果“Yeast-Based Whole-Cell Factory for the Ecofriendly Synthesis of Vanillylamine as a Critical Step toward Capsaicin Production”。該研究團隊在解析香草胺生物合成途徑基礎上,構建了以苯丙氨酸和酪氨酸為前體的香草胺酵母全合成體系。

 

研究人員利用酵母異源重組香草胺生物合成途徑得到香草胺的產(chǎn)率為6.47 g/L,然后通過上調莽草酸途徑來增強苯丙氨酸使香草胺的產(chǎn)量增了11%,進一步的通過重組的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)循環(huán)優(yōu)化甲基轉移效率,使香草胺產(chǎn)量提高了84%,最后將酵母菌株從Z2切換到Z6,并重新連接了前體和SAM循環(huán),在1L平行生物反應器(迪必爾生物)上進行了測試,最終香草胺的產(chǎn)量提高到了14.89 g/L(125%),這是目前公開數(shù)據(jù)中的最高水平。

 

研究路線

 

一、釀酒酵母生產(chǎn)香草胺生物合成途徑的建立

 

為了構建香草胺生產(chǎn)菌株,研究人員設計了兩個模塊:咖啡酰輔酶A合成模塊和香草胺合成模塊(圖2)
 

圖2 香草胺和辣椒素在工程酵母中的生物合成途徑

 

模塊1涉及前體咖啡酰基輔酶A的合成,需要四種酶的催化,包括苯丙氨酸銨裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羥基酰化酶(C4H)、肉桂酰連接酶(4CL)和羥基肉桂酰轉移酶(HCT)。

 

研究人員在含有500 mg/L苯乙醇、0.18mg/L CAPE和49.9 mg/L對香豆酸的YPD培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵測試,通過HPLC - MS/MS檢測搖瓶發(fā)酵結果(圖3a)。出乎意料的是,在工程菌株Z1-1中檢測到2.94 mg/L阿魏酸(圖3a)。而阿魏酸理論上應該由下一步的CAMT產(chǎn)生,這一發(fā)現(xiàn)暗示在Z1-1菌株中可能發(fā)生了一些未知的反應。

 

模塊2涉及將咖啡酰輔酶A轉化為香草胺,并要求表達咖啡酰輔酶A-氧-甲基轉移酶(CAMT)、阿魏酰輔酶A水合酶/裂解酶(FerB)和推測的轉氨酶(pAMT)。模塊2轉化過程中需要CAMT、 FerB和pAMT這三種酶。研究人員通過優(yōu)化得到了Z2菌株,接著在1L平行生物反應器中利用分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)96 h后,Z2菌株產(chǎn)生6.47 g/L的香草胺(圖4b),因此在釀酒酵母中首次實現(xiàn)了香草胺的從頭生物合成。并在Z2菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中檢測到肉桂酸(86.14 mg/L)和咖啡酸(2.36 mg/L)等中間產(chǎn)物(圖3a),表明兩個模塊之間協(xié)同作用良好。
 


圖3 工程菌株在培養(yǎng)96 小時的中間產(chǎn)物分析

(a)96h時Z1-1和Z2菌株中間產(chǎn)物含量

(b)工程菌株補料批次發(fā)酵過程中OD₆₀₀與時間的關系

(c)96h時對工程菌株(Z2、Z3、Z4和Z5)中的酚酸進行定量分析

(d)96h時在所有測試菌株(Y1和Y2)的發(fā)酵液中檢測原兒茶酸。

(e)香草胺生產(chǎn)的推測途徑。



圖4 工程酵母合成香草胺

(a)采用高效液相色譜法對香草胺進行了定性分析。

(b)在96h時通過HPLC對香草胺的產(chǎn)生進行定量。

 

二、另一種香草胺的生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)

 

研究人員發(fā)現(xiàn)在Z2菌株中中間產(chǎn)物較低,為了增加苯丙氨酸和酪氨酸的通量,將TAL、Aro9和PheA引入Z2菌株的δ1位點,構建了Z3菌株。

 

對Z3菌株進行了發(fā)酵測試,測試條件為在初始葡萄糖濃度為2%的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,Z3菌株的香草胺產(chǎn)量為7.16 g/L,比Z2菌株增加了11%(圖4b)。但肉桂酸的積累明顯減少,Z3的肉桂酸積累量為18.91 mg/L,僅為Z2積累量的21%。

 

此外,還檢測到原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸三種新化合物,滴度分別為23.38mg/L、20.51mg/L和5.24 mg/L(圖3c)。

 

經(jīng)過一系列的研究測試,發(fā)現(xiàn)了另一條香草胺的生物合成途徑,通過增加苯丙氨酸和酪氨酸的供應增加了香草胺的產(chǎn)量。

 

三、調節(jié)SAM生物合成來提高香草胺的生產(chǎn)

 

咖啡酰輔酶A轉化為阿魏酰輔酶A以及原兒茶酸轉化為香草酸都需要甲基化,其中SAM充當甲基供體。研究人員采用兩種策略通過重構SAM循環(huán)來提高甲基轉移效率。利用釀酒酵母的SAHase編碼基因(SahH)和擬南芥的MAT編碼基因(SAM2)共轉化到Z2或Z3菌株的rDNA整合位點分別構建了Z4或Z6菌株。此外,將大腸桿菌的Mtn和LuxS與SAM2共轉化到Z2或Z3菌株,分別產(chǎn)生了Z5或Z7菌株。

 

接著研究人員將得到的Z4、Z5、Z6和Z7菌株在1L平行生物反應器中進行了發(fā)酵測試,發(fā)酵條件為:溫度30°C,初始葡萄糖為20g/L,發(fā)酵24小時后每12小時進行一次補料操作,直到96小時發(fā)酵結束。在發(fā)酵過程中使用氫氧化鈉/硫酸控制pH保持在7.0。結果顯示,Z4和Z5菌株的香草胺滴度分別為9.21和11.88 g/L(圖4b),與工程Z2菌株相比,滴度分別提高了42%和84%。此外,在Z6和Z7菌株中分別檢測到14.89g/L和14.07g/L的香草胺,與Z2菌株相比增加了125%。

 

這些結果表明,這兩種策略都有效地改善了SAM作為甲基轉移反應的甲基供體的積累,從而促進了代謝途徑的平衡。

 

此外,他們也發(fā)現(xiàn)了與野生型酵母(CK)相比,所有工程菌株的生物量都有所減少(圖3b)。在發(fā)酵96小時后,Z4、Z5、Z6和Z7的生物量分別下降了25%、13%、10%和18%,積累的醋酸鹽分別達到了2.28g/L、3.03g/L、2.06g/L和2.95g/L。因此,可能的原因為香草胺和醋酸會抑制菌株的生長與活力。

 

四、在酵母細胞中通過香草胺的酯化實現(xiàn)了辣椒素的從頭合成。

 

在辣椒素合成酶(CS)的催化下,香草胺能與8-甲基-6-壬烯酰輔酶A酯化反應生成辣椒素。在此基礎上,研究人員設計了模塊3,并在初始Z2菌株上構建了C1菌株,在1L的平行反應器上做了相應的發(fā)酵測試,采用補料批次培養(yǎng)策略,發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖濃度為20g/L,培養(yǎng)120h,辣椒素的產(chǎn)量為80.23μg/L(圖5),因此實現(xiàn)了辣椒素在釀酒酵母細胞上的重頭合成。此外,在C1菌株中還檢測到142.46 g/L的8-甲基-6-壬烯酰輔酶A和6.02 g/L的香草胺。8-甲基-6-壬烯酰輔酶A供應過慢可能會限制辣椒素的生產(chǎn)。

 

因此,增加8-甲基-6-壬烯基酰輔酶A的積累將是酵母生產(chǎn)辣椒素的潛在有益途徑。
 

圖5 工程酵母合成辣椒素

(a) 采用HPLC - MS/MS對辣椒素標準品進行定性分析

(b) 采用HPLC - MS/MS對樣品進行定性分析


參考文獻 

Zhao, J. , Li, Y. , Yi, L. , Zhang, G. , & Ye, B. . (2023). Yeast-based whole-cell factory for the ecofriendly synthesis of vanillylamine as a critical step toward capsaicin production. ACS Sustainable Chemistry & Engineering.
 

平行生物反應器

研究使用的1L生物反應器屬于迪必爾生物的Minibox 系列平行生物反應器。
 


圖6 Minibox 5  第5代平行生物反應器

 

迪必爾平行生物反應器從最初的minibox 1到minibox 5(圖6),再到2021年推出的顛覆性產(chǎn)品——CloudReady™️云生物反應器(圖7),迪必爾一直致力于協(xié)助合成生物學領域科學家進行科研與創(chuàng)新。CloudReady™️云生物反應器整合了多種補料策略,同時產(chǎn)品軟件中內置實驗設計(DoE)與分析軟件可以幫助用戶快速的進行布局實驗,縮短產(chǎn)品的開發(fā)周期。
 

圖7  CloudReady ™️云生物反應器

 

D²MS軟件內置3D Visual DoE可視化實驗設計:

· 可交互三維圖形展示實驗設計,使實驗設計不再抽象,富有趣味性。

· 內置多項式回歸響應曲面數(shù)據(jù)分析,使實驗設計到數(shù)據(jù)分析一氣呵成,提高效率,避免人為影響。

支持結果導出為CSV格式,支持第三方工具進行數(shù)據(jù)分析。
 

發(fā)布者:迪必爾生物工程(上海)有限公司
聯(lián)系電話:021-57640001
E-mail:zhimengmeng@parallel-bioreactor.com

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