Simoa®單分子蛋白檢測技術(shù)由現(xiàn)任于哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的David Walt教授作為科學(xué)創(chuàng)始人于2007年創(chuàng)立。David Walt 是美國的工程院，藝術(shù)院和醫(yī)學(xué)院 三院院士。2010年，David Walt 將 Simoa® 技術(shù)以封面文章的形式發(fā)表在《 Nature Biotechnology》上，此技術(shù)開始為大眾所知并引起業(yè)界轟動。
 

Simoa®特點是其超高的靈敏度，較傳統(tǒng)ELISA方法能夠高出3個數(shù)量級，達到飛克級別(fg/ml)甚至更低，因此可以直接在外周血中檢測健康人群中的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的基線表達，而不是傳統(tǒng)方法學(xué)的疾病發(fā)生后，實現(xiàn)探索冰山下更廣闊的蛋白檢測。
 

那Simoa技術(shù)是如何輕松實現(xiàn)多重檢測呢？我們來一探究竟！

Simoa單分子蛋白檢測技術(shù)工作流程

Simoa@技術(shù)是一項基于磁珠的實驗技術(shù),磁珠直徑為2.7um,在磁珠表面,捕獲抗體會通過化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)到磁珠上。每個磁珠表面有約250000個結(jié)合位點用于和捕獲抗體結(jié)合。結(jié)合了抗體的磁珠會和目的抗原結(jié)合,然后加入生物素標(biāo)記的檢測抗體,形成雙抗夾心的免疫復(fù)合物。生物素標(biāo)記的檢測抗體會進一步和親和素標(biāo)記的酶結(jié)合,Simoa@使用的是半乳糖甘酶。此時,如果樣本中含有目標(biāo)抗原,則磁珠會帶有酶標(biāo)記,而不含有目的抗原的磁珠則保持無標(biāo)記物。
 

接下來,系統(tǒng)會洗滌磁珠以除去任何非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后加入酶反應(yīng)底物,Simoa@技術(shù)的真正關(guān)鍵之處就在于此時含有免疫復(fù)合物的磁珠轉(zhuǎn)移到Simoa@光盤上每個光盤有24個芯片(Array),而單個Array表面有239000個小孔(wel),每個小孔的直徑是4.25um,剛好一個磁珠落入一個小孔,小孔的反應(yīng)體系是50飛升,基于磁力的作用磁珠會迅速沉入小孔中,然后系統(tǒng)會在Array表面推一層油,通過這一層油一方面將部分多余的磁珠去除,另一方面將熒光信號很好地密封在小孔中(不易信號擴散和交叉反應(yīng))。
 

由于50飛升的反應(yīng)體系極小,比傳統(tǒng)100ul的體系小了20億倍,此時即使一個的目的蛋白分子其催化底物產(chǎn)生可以產(chǎn)生約3000個熒光分子,被儀器的CCD攝像頭捕獲并進行數(shù)字化成像分析。所以Simoa@僅需要一個蛋白分子就可以達到檢測底限,幾乎沒有信號的稀釋(Diffusion defeated),實現(xiàn)單分子的檢測。

Simoa 與傳統(tǒng) ELISA 的區(qū)別

Simoa® 單分子蛋白檢測技術(shù)「多重檢測」原理

Simoa實現(xiàn)多重檢測，主要是基于磁珠可以包被不同的熒光的染料。在單重檢測的時候，磁珠包被的染料在LED激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，主要通過488通道可以實現(xiàn)落孔磁珠的檢測。
 

在進行多重檢測時，整個檢測流程不變，但事先會給磁珠包被不用的染料（如下圖所示，可以包被淺紫色，深紫色和藍色），這些磁珠在LED激發(fā)后會發(fā)出不同顏色的光，比如750發(fā)出紅光，通過濾光片可以在750，700和647通道檢測到這些磁珠發(fā)出的熒光，不同染料的磁珠對應(yīng)包被不同的捕獲抗體，比如淺紫色磁珠對應(yīng)包被Aβ40抗體，綠色磁珠對應(yīng)包被Aβ40抗體Aβ42，藍色磁珠對應(yīng)包被NfL抗體, 紫色磁珠對應(yīng)包被GFAP抗體，這就明確了每一種磁珠對應(yīng)的檢測靶標(biāo)的信息。
 

在檢測過程中，對于每個樣本孔，總計會有7張照片的拍攝。第一張是白光，主要用于拍攝每個芯片中所有的孔；第二張，是在577通道，用于檢測酶催化底物發(fā)出的黃光，同時記錄時間T0;第三張，拍攝750通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第四張，拍攝700通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第五張，拍攝通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第六張，與第二張通道相同，也是在577通道，用于檢測酶催化底物發(fā)出的黃光，同時記錄時間T2，和第一張間隔30秒時間，如果孔內(nèi)的確有抗原，酶催化底物，在30秒內(nèi)，會有熒光信號的增加，當(dāng)信號增加大于一定閾值認(rèn)為孔內(nèi)確實有抗原；第七張，拍攝488通道的發(fā)光情況，主要用于檢測單重beads信號。通過高清攝像對7張張照片的拍攝和解讀，實現(xiàn)了多重目的蛋白的特異性檢測。

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