期刊：Arthritis and Rheumatology
影響因子：13.3
伯豪技術服務：時空組學

研究背景
類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是一類自身免疫性疾病，其主要以多關節滑膜炎、血管翳形成以及軟骨與骨侵蝕為主要病理表現。生物制劑（bDMARDs）的應用讓大部分RA患者受益，但是仍然有30%-40%的患者對多種bDMARDs反應較差，揭示了RA中存在潛在的且未被重視的通路和靶點，以及對這些通路和靶點進行深入探索的必要性。與長期處于緩解期的RA患者相比，活動期的RA患者關節破壞的風險和進程明顯增加。因此，解析RA患者關節局部免疫微環境在活動期和緩解期的差異性，探索關節破壞的發生過程，對于保護RA患者的關節至關重要。

研究技術
ScRNA-SEQ，ST

研究內容
結合單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和空間轉錄組學，本研究對來自 3 名復發 RA 患者和 3 名緩解期患者的 6 個匹配的滑膜組織樣本進行了測序。使用 scRNA-seq 鑒定內襯和亞襯 FLS 子集；分析了復發期和緩解期之間 FLS 子集轉錄組的差異。差異分析表明，復發性 RA 患者的內膜 FLS 中成纖維細胞生長因子 (FGF) 通路高度激活，mIHC 證實 FGF10 表達增加。雖然 I 型干擾素通路也在內層 FLS 中被激活，但體外刺激實驗表明它獨立于 FGF10 通路。FLS 中 siRNA 敲低 FGF10 顯著降低 RANKL 的表達。此外，重組 FGF10 蛋白增強了原代人源血管翳細胞培養物中的骨侵蝕，而 FGFR1 抑制劑則減弱了這一過程。最后，施用 FGFR1 抑制劑在 CIA 大鼠模型中顯示出治療效果。

技術路線圖

圖1

2. 復發和緩解 RA 的 FLS 子集顯示出不同的激活途徑
鑒于 FLS 在 RA 發病機制中的關鍵作用，研究特別關注 FLS 亞群在 RA 復發和緩解中的作用。經過質量控制，獲得了 22,679 個高質量的 FLS，根據差異表達基因 (DEG) 將其分為四個子集：CD55+ 襯里成纖維細胞 (FB L-CD55)、CXCL12+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-CXCL12)（圖 2A 和 C） 、MFAP5+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-MFAP5) 和 VEGFA+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-VEGFA)（圖 2A）。通過整合單細胞測序數據和公共數據庫的數據，觀察到復發性 RA 中 CD55+ 內襯成纖維細胞的比例很高，這表明內膜成纖維細胞在復發 RA 中顯著增殖（圖 2B）。通過對DEG 進行聚類來生成熱圖，以深入了解復發和緩解 RA 中 FLS 的四個子集的分子特征差異（圖 2D）。發現 FB L-CD55 和 FB S-CXCL12 在復發和緩解 RA 之間存在顯著差異。FB L-CD55 表達與基質金屬蛋白酶 (MMP) 和脂多糖結合蛋白 (LBP) 相關的基因， MMP加速軟骨降解， LBP表明復發 RA 中先天免疫反應的上調（圖 2D）。FB S-CXCL12 在復發性 RA 中表達與 MHC II 類呈遞和補體激活途徑 (C3) 相關的基因（圖 2D）。接下來，研究基于 Hallmark 和 Reactome 數據集對 FLS 子集進行了通路分析（圖 2E）。發現，來自復發性 RA 的 FB L-CD55 中的干擾素 α (IFN-α)、干擾素 γ (IFN-γ) 和成纖維細胞生長因子受體 1 (FGFR1) 通路高度激活。在緩解期 RA 中，FB L-CD55 和 VEGFA+ 成纖維細胞 (FB S-VEGFA) 中高度富集凋亡和缺氧途徑。這些數據表明，FLS 亞群具有不同的基因表達模式，受不同的復發和緩解 RA 途徑調節。
 

圖2

3. FGF10-FGFR1信號通路在復發性RA的內層FLS中異常激活
CellChat 分析顯示，FB L-CD55 與復發 RA 中的其他 FLS 子集具有強烈的 FGF 信號通路相互作用（圖 3A）。此外，研究觀察到 FGF10-FGFR1 對在復發 RA 的 FB L-CD55 中高度激活（圖 3B，左）。對于亞襯FLS，FGF7-FGFR1 對占主導地位；然而，復發和緩解 RA 之間沒有明顯差異（圖 3B，右）。對不同 FLS 亞群中 FGF7、FGF10 和 FGF14 轉錄組表達水平的進一步分析表明，FGF10 在復發 RA 的 FB L-CD55 細胞中高表達（圖 3C）。使用 mIHC，研究確認 PDPN+FGF10+ FLS 主要在復發 RA 的血管翳內層中檢測到（圖 3D）。通過 IHC 對復發和緩解 RA 患者的 12 個血管翳樣本中的 FGF10 表達進行定量分析顯示，復發 RA 患者中 FGF10 陽性區域的比例顯著高于緩解 RA 患者（圖 3E 和 F）。通過結合 scRNAseq 和 IHC 數據，證明了復發 RA 內膜 FLS 中 FGF10-FGFR1 信號通路的過度激活。
 

圖3

4. IFN-α和FGFR1信號通路在復發性RA中很大程度上是獨立的
鑒于 IFN-α 和 FGFR1 信號通路主要在復發 RA 的內層 FLS 中激活，本研究探討了這兩種通路之間是否存在交叉調節。首先，通過比較來自 scRNA-seq 數據的 FLS 中的兩個通路評分來進行相關性研究。未觀察到 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與總 FLS 或復發或緩解 RA 的 FLS 之間存在任何已建立的相關性 (R>0.3)（圖 4A 和 B）。這些結果表明這兩條途徑在單細胞水平上很大程度上是獨立的。

為了證實這些發現，進行了體外刺激實驗。用重組人干擾素α2a（IFN-α2a）或FGF10蛋白刺激MH7A FLS細胞系6小時，并通過qRT-PCR測量目標分子。與未刺激的對照組相比，IFN-α2a刺激MH7A FLS細胞系以劑量依賴性方式誘導了預期的IFI6和ISG15 mRNA表達；然而，沒有觀察到 FGF10 mRNA 的顯著變化（圖 4C）。同時，用 10 ng/ml 和 100 ng/ml FGF10 刺激 MH7A FLS 細胞系對 IFI6 和 ISG15 mRNA 的表達幾乎沒有影響（圖 4D）。總的來說，本研究提供了初步證據表明 IFN-α 和 FGFR1 信號通路不太可能相互交叉調節。
 

圖4

5. 襯里 FLS 中的 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與復發 RA 中的不同代謝通路存在差異相關
既往對RA和OA滑膜成纖維細胞代謝的研究表明，缺氧和糖酵解是RA滑膜成纖維細胞的特征。研究觀察到復發和緩解 RA 中的 FLS 亞群表現出不同的代謝活動（圖 5A）。在襯里成纖維細胞（FB L-CD55）中高度富集的代謝途徑中，花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、氧化磷酸化、泛酸和CoA生物合成在復發性RA中占主導地位。相比之下，煙酸鹽和煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及糖酵解/糖異生在 RA 緩解中普遍存在。

相關分析顯示，IFN-α信號通路與亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸代謝密切相關（圖5B和C）。相反，FGFR1信號通路與代謝通路的相關性較小，與賴氨酸降解和粘蛋白型O-聚糖生物合成的相關性較弱（圖5B和D）。這些數據表明 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與復發性 RA 襯里 FLS 中的不同代謝通路相關。
 

圖5

6. 阻斷 FGFR1 信號通路可減輕體外骨侵蝕，并在大鼠關節炎模型中顯示治療效果
研究進行 Transwell 侵襲實驗來探討 FGF10/FGFR1 信號在 FLS 侵襲性中的潛在作用。與siNC和siFGF7相比，siFGF10顯著抑制FLS的侵襲能力（圖6A和B）。通過蛋白質印跡進一步測量了與 FLS 侵襲性相關的幾種基質金屬蛋白酶 (MMP)。結果顯示，與siFGF7和siNC相比，siFGF10顯著抑制MMP2的表達（圖6C和D）。基于此，假設 FGF10/FGFR1 信號傳導促進復發性 RA 中 FLS 的侵襲性，并且 MMP2 參與了這一過程。除了MMP2之外，發現與siFGF7和siNC相比，siFGF10強烈抑制RANKL的表達（圖6C和D），這表明FGF10/FGFR1途徑可能參與復發性RA的破骨細胞生成。 
 

圖6