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使用高分辨熔解曲線法(HRM)進(jìn)行基因分型的原理和優(yōu)缺點(diǎn)

瀏覽次數(shù):4794 發(fā)布日期:2023-9-13  來源:酷搏科技
高分辨熔解曲線(High Resolution Melting, HRM)分析是使用熒光定量PCR儀和雙鏈DNA染料,在PCR擴(kuò)增后通過實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過程中雙鏈DNA解鏈的過程,對(duì)DNA片段進(jìn)行檢測(cè)。
 
HRM基本原理:
1、兩種(或多種)基因型的qPCR引物序列相同,位于突變位點(diǎn)的上下游。
2、在包含飽和雙鏈染料(如LC Green、EvaGreen等)的qPCR體系中加入引物與樣本,在qPCR程序中擴(kuò)增至接近飽和(一般30-40循環(huán))后,進(jìn)行熔解曲線分析(緩慢升溫過程中連續(xù)記錄樣本熒光)。
3、通過與已知基因型樣品比較熔解曲線的形狀,確定未知樣品的基因型。

 
 

HRM方法優(yōu)點(diǎn):
1、比熒光探針法體系簡(jiǎn)單
2、比熒光探針法成本低
3、可以提示存在其它未知類型的突變
 
HRM方法缺點(diǎn):
1、經(jīng)典方法分辨A/T或C/G單堿基突變難度較大。
2、解鏈溫度受Mg2+濃度和一些抑制劑影響較大,對(duì)樣本純化、加樣準(zhǔn)確度的要求稍高。
 
在酷搏科技Quantagene q225/q900熒光定量PCR儀上使用HRM進(jìn)行基因分型的優(yōu)勢(shì):
1、整板一次成像,避免在線性升溫過程中掃描不同孔帶來的溫度差。
2、孔間溫度一致性高,結(jié)果準(zhǔn)確度高。
3、HRM軟件模塊功能強(qiáng)大,可用多種方式作圖分析。
4、速度快,分辨率優(yōu)于0.02°C/點(diǎn)的HRM程序僅需約20分鐘完成,相當(dāng)于其它品牌儀器的普通熔解曲線運(yùn)行時(shí)間。
5、5-10μl體系,比常規(guī)方法節(jié)省50%-90%的試劑,大幅降低檢測(cè)成本。
 


對(duì)于某位于人類1號(hào)染色體的50bp基因片段,分別使用第25位堿基為C的野生型基因及該位點(diǎn)突變?yōu)锳,T,G或被刪除的突變型基因?yàn)槟0澹褂孟嗤锛皩?shí)驗(yàn)條件在q225熒光定量PCR儀上進(jìn)行高分辨熔解曲線實(shí)驗(yàn)。圖中所示為不同突變類型模板之間的歸一化熔解曲線差值圖。
 
其它說明:
1、HRM的引物設(shè)計(jì)一般需要符合qPCR的引物設(shè)計(jì)要求,且在滿足包含突變位點(diǎn)的要求下擴(kuò)增片段盡量短。
2、建議至少加入兩種純合、50%雜合的樣本,以對(duì)未知樣本進(jìn)行比較。
3、包含SYBR Green的qPCR試劑也可以分辨一些突變,但分辨率一般沒有LC Green或EvaGreen好。
4、可以通過包含在引物3’端包含突變位點(diǎn)的兩對(duì)或多對(duì)引物設(shè)計(jì),對(duì)不同基因型產(chǎn)生不同的PCR產(chǎn)物(如ARMS PCR或One-step ARMS qPCR)。此方法結(jié)合熔解曲線分析,可對(duì)SNP取得更好的區(qū)分效果。
發(fā)布者:北京酷搏科技有限公司
聯(lián)系電話:010-82839099
E-mail:sales@kubotechnology.com

標(biāo)簽: 熒光定量PCR 基因分型 HRM
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