使用高分辨熔解曲線法（HRM）進(jìn)行基因分型的原理和優(yōu)缺點(diǎn)
高分辨熔解曲線（High Resolution Melting, HRM）分析是使用熒光定量PCR儀和雙鏈DNA染料，在PCR擴(kuò)增后通過實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過程中雙鏈DNA解鏈的過程，對(duì)DNA片段進(jìn)行檢測(cè)。
HRM基本原理：
1、兩種（或多種）基因型的qPCR引物序列相同，位于突變位點(diǎn)的上下游。
2、在包含飽和雙鏈染料（如LC Green、EvaGreen等）的qPCR體系中加入引物與樣本，在qPCR程序中擴(kuò)增至接近飽和（一般30-40循環(huán)）后，進(jìn)行熔解曲線分析（緩慢升溫過程中連續(xù)記錄樣本熒光）。
3、通過與已知基因型樣品比較熔解曲線的形狀，確定未知樣品的基因型。
HRM方法優(yōu)點(diǎn)：
1、比熒光探針法體系簡(jiǎn)單。
2、比熒光探針法成本低。
3、可以提示存在其它未知類型的突變。
HRM方法缺點(diǎn)：
1、經(jīng)典方法分辨A/T或C/G單堿基突變難度較大。
2、解鏈溫度受Mg2+濃度和一些抑制劑影響較大，對(duì)樣本純化、加樣準(zhǔn)確度的要求稍高。
在酷搏科技Quantagene q225/q900熒光定量PCR儀上使用HRM進(jìn)行基因分型的優(yōu)勢(shì)：
1、整板一次成像，避免在線性升溫過程中掃描不同孔帶來的溫度差。
2、孔間溫度一致性高，結(jié)果準(zhǔn)確度高。
3、HRM軟件模塊功能強(qiáng)大，可用多種方式作圖分析。
4、速度快，分辨率優(yōu)于0.02°C/點(diǎn)的HRM程序僅需約20分鐘完成，相當(dāng)于其它品牌儀器的普通熔解曲線運(yùn)行時(shí)間。
5、5-10μl體系，比常規(guī)方法節(jié)省50%-90%的試劑，大幅降低檢測(cè)成本。
對(duì)于某位于人類1號(hào)染色體的50bp基因片段，分別使用第25位堿基為C的野生型基因及該位點(diǎn)突變?yōu)锳,T,G或被刪除的突變型基因?yàn)槟０澹褂孟嗤锛皩?shí)驗(yàn)條件在q225熒光定量PCR儀上進(jìn)行高分辨熔解曲線實(shí)驗(yàn)。圖中所示為不同突變類型模板之間的歸一化熔解曲線差值圖。
其它說明：
1、HRM的引物設(shè)計(jì)一般需要符合qPCR的引物設(shè)計(jì)要求，且在滿足包含突變位點(diǎn)的要求下擴(kuò)增片段盡量短。
2、建議至少加入兩種純合、50%雜合的樣本，以對(duì)未知樣本進(jìn)行比較。
3、包含SYBR Green的qPCR試劑也可以分辨一些突變，但分辨率一般沒有LC Green或EvaGreen好。
4、可以通過包含在引物3’端包含突變位點(diǎn)的兩對(duì)或多對(duì)引物設(shè)計(jì)，對(duì)不同基因型產(chǎn)生不同的PCR產(chǎn)物（如ARMS PCR或One-step ARMS qPCR）。此方法結(jié)合熔解曲線分析，可對(duì)SNP取得更好的區(qū)分效果。
HRM基本原理：
1、兩種（或多種）基因型的qPCR引物序列相同，位于突變位點(diǎn)的上下游。
2、在包含飽和雙鏈染料（如LC Green、EvaGreen等）的qPCR體系中加入引物與樣本，在qPCR程序中擴(kuò)增至接近飽和（一般30-40循環(huán)）后，進(jìn)行熔解曲線分析（緩慢升溫過程中連續(xù)記錄樣本熒光）。
3、通過與已知基因型樣品比較熔解曲線的形狀，確定未知樣品的基因型。
HRM方法優(yōu)點(diǎn)：
1、比熒光探針法體系簡(jiǎn)單。
2、比熒光探針法成本低。
3、可以提示存在其它未知類型的突變。
HRM方法缺點(diǎn)：
1、經(jīng)典方法分辨A/T或C/G單堿基突變難度較大。
2、解鏈溫度受Mg2+濃度和一些抑制劑影響較大，對(duì)樣本純化、加樣準(zhǔn)確度的要求稍高。
在酷搏科技Quantagene q225/q900熒光定量PCR儀上使用HRM進(jìn)行基因分型的優(yōu)勢(shì)：
1、整板一次成像，避免在線性升溫過程中掃描不同孔帶來的溫度差。
2、孔間溫度一致性高，結(jié)果準(zhǔn)確度高。
3、HRM軟件模塊功能強(qiáng)大，可用多種方式作圖分析。
4、速度快，分辨率優(yōu)于0.02°C/點(diǎn)的HRM程序僅需約20分鐘完成，相當(dāng)于其它品牌儀器的普通熔解曲線運(yùn)行時(shí)間。
5、5-10μl體系，比常規(guī)方法節(jié)省50%-90%的試劑，大幅降低檢測(cè)成本。
對(duì)于某位于人類1號(hào)染色體的50bp基因片段，分別使用第25位堿基為C的野生型基因及該位點(diǎn)突變?yōu)锳,T,G或被刪除的突變型基因?yàn)槟０澹褂孟嗤锛皩?shí)驗(yàn)條件在q225熒光定量PCR儀上進(jìn)行高分辨熔解曲線實(shí)驗(yàn)。圖中所示為不同突變類型模板之間的歸一化熔解曲線差值圖。
其它說明：
1、HRM的引物設(shè)計(jì)一般需要符合qPCR的引物設(shè)計(jì)要求，且在滿足包含突變位點(diǎn)的要求下擴(kuò)增片段盡量短。
2、建議至少加入兩種純合、50%雜合的樣本，以對(duì)未知樣本進(jìn)行比較。
3、包含SYBR Green的qPCR試劑也可以分辨一些突變，但分辨率一般沒有LC Green或EvaGreen好。
4、可以通過包含在引物3’端包含突變位點(diǎn)的兩對(duì)或多對(duì)引物設(shè)計(jì)，對(duì)不同基因型產(chǎn)生不同的PCR產(chǎn)物（如ARMS PCR或One-step ARMS qPCR）。此方法結(jié)合熔解曲線分析，可對(duì)SNP取得更好的區(qū)分效果。
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