2023年4月7日，浙江大學逯慧杰老師課題組應用長光辰英核心產品——P300共聚焦拉曼光譜儀和S3000超快三維熒光成像系統在《ACS ES&T Water》期刊上發表了題為“Phosphorus Removal and Storage Polymer Synthesis by Tetrasphaera-Related Bacteria with Different Carbon Sources”的論文。本研究整合了共聚焦拉曼光譜和熒光原位雜交技術來理解Tetrasphaera-PAO的代謝差異。


在廢水的處理中，生物除磷比化學除磷更具成本效益和可持續性。聚磷菌(PAO)在富碳厭氧(FEAST)條件下使用聚磷酸鹽(Poly-P)作為能源，將碳源轉化為生物大分子，如聚羥基烷酸酯(PHA)。在隨后的缺碳好氧(饑荒)條件下，磷酸鹽以多聚形式積累。有機碳源是影響磷釋放和吸收活性的關鍵因素。

Tetrasphaera能夠利用葡萄糖和氨基酸作為碳源。這些化合物提供了吸收磷所需的90%的能量，乙酸鹽、葡萄糖和甘油是強化廢水反硝化的常用碳源，并對其除磷動力學和化學計量進行了比較。利用上述碳源，還沒有揭示Tetrasphaera-PAO的碳磷代謝特性。這項研究的總體目標是揭示與Tetrasphaera相關的PAO的代謝多樣性以及不同碳源對其C和P代謝的調節。

具體目標是：
(1)確定在復合有機物(酪蛋白氫裂解物)補給的除磷生物反應器中Tetrasphaera-PAO的系統發育和代謝潛力；(2)揭示不同碳源(即乙酸鹽、葡萄糖和甘油)的Tetrasphaera-PAO的C和P代謝特征；以及(3)建立不同碳源下Tetrasphaera-PAO的代謝和能量模型。利用熒光原位雜交技術(FISH)結合和拉曼光譜對Tetrasphaera-PAO中的多聚P、糖原和PHA等細胞內儲存化合物進行了原位定量。預期結果將為深入了解Tetrasphaera-PAO的碳來源依賴的代謝及其對全球廢水除磷的貢獻提供洞察。
 
在本研究中，我們確定了一個新的分支，Tetrasphaera為主要的聚磷菌在實驗室規模的除磷反應器中富集。Tetrasphaera-PAOs在乙酸鹽下的釋磷和吸磷效率均高于甘油和葡萄糖。甘油和葡萄糖發酵提供的能量分別是多聚磷水解法的4倍和1.7倍，兩者之間的權衡導致磷的釋放較差。拉曼熒光原位雜交結果表明，聚羥基烷酸酯(PHA)是由乙酸酯合成的。另一方面，糖原是甘油和葡萄糖形成的關鍵儲能化合物。乙酸乙酯的好氧磷吸收效率分別是甘油和葡萄糖的4.4倍和1.8倍，這是因為PHA的水解提供了額外的能量。Tetrasphaera-PAO的代謝多樣性和發酵能力支持它們在EBPR中的流行，并強調了它們與群落中其他種群潛在的代謝相互作用。這項工作加深了我們對Tetrasphaera-PAO遺傳和代謝差異的理解，為在不同的碳源條件下優化廢水除磷提供了有用的信息。
由圖2的研究結果，可以看出PAO包括C. accumulibacter(從4.97%到168天的0)和Microlunatus phosphovorus(168天<0.2%)，被Tetrasphaera-PAOs 擊敗并在實驗操作中被淘汰(圖2和圖3)。這可能是因為這些種群更喜歡使用小分子有機物，如乙酸鹽。Candidatus competibacter，典型的GAOs，從0.03%增加到1.71%，可以與Tetrasphaera-PAO競爭氨基酸。



圖2. (A)SBR群落中PAO和GAO種群的動態。數字和氣泡大小代表基于元基因組學的相對豐度(%)。(B)第168天SBR污泥的FISH圖像。Tetrasphaera-PAO以紅色顯示，Eubacteria以綠色顯示
  上述圖4結果表明分支1−3編碼兩條乙酰輔酶A合成途徑，分別涉及ACs和Ack-PTA，而分支4缺少ackA，因此可能僅使用ACs途徑(比Ack-Pta途徑消耗更多的ATP)。大多數Tetrasphaera-PAO(6/9 MAGs)缺乏甘油運輸復合蛋白，導致甘油吸收的效率較低。在葡萄糖利用方面，分支1−3可以從葡萄糖合成糖原或通過糖酵解(通過傳統的Embden−Meyerhof−Parna，或emp途徑)將葡萄糖轉化為丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸酯，其中所有相關基因都是完整的。分支4 包含完整的糖原合成途徑，但缺少編碼6-磷酸果糖激酶的pfk1，從而催化EMP途徑中從6-磷酸果糖到1,6二磷酸果糖的速率限制步驟。另一種選擇是，分支4可能使用Entner−Doudoroff途徑進行糖酵解，該途徑比EMP途徑更短，但產生的ATP更少。
 
Tetrasphaera PAO的胞內多聚P、PHA和糖原作為P和C的儲存化合物因使用的碳源而不同(圖5)。在厭氧−好氧轉化過程中，乙酸鹽的釋放和吸收是最有效的，導致胞內多聚磷的含量發生了劇烈的變化(相差2.75倍)。葡萄糖和甘油、PolyP變異相似(分別相差1.75倍和1.45倍)。另一方面，厭氧PHA只對乙酸酯有積累，而對葡萄糖和甘油沒有。然后在好氧階段消耗一小部分PHA(從7.39×10−13降至6.92×10−13 g C/cell)。甘油和葡萄糖的糖原積累和降解規律相似。然而，當加入乙酸鹽時，糖原在厭氧階段迅速消耗能量，在好氧階段持續減少。值得注意的是，拉曼FISH能夠原位量化目標細胞中的聚合物含量，而不是群落其他成員。此技術的準確性可以通過細胞分選和單細胞測序技術進行驗證。上述結果證實了分支4 Tetrasphaera-PAOs具有從乙酸鹽合成PHA的潛力，不同于以前的研究表明大多數Tetrasphaera不能合成PHA。
 
為了進一步驗證所構建的 Tetrasphaera-PAO吸收不同碳源的代謝模型(圖4)，用Tetrasphaera-PAO的特異引物通過RT-qPCR定量測定了參與合成和儲存化合物水解的關鍵基因的表達水平(圖6)。這一結果與觀察到的三種碳源的糖原積累、多聚磷水解和積累模式是一致的。甘油和葡萄糖在厭氧期的GALU(編碼糖原合成酶)的變化比乙酸乙酯高5−7倍。在Tetrasphaera-PAO中，確實有甘油和葡萄糖被轉化為糖原作為儲能化合物。此外，ppk2(聚P水解酶)對乙酸酯的上調作用最強，對甘油的上調作用最低。ppk(多聚磷合成)在乙酸鹽的上調作用最強，在葡萄糖的作用下最低。
 
在本研究中，在實驗室規模的除磷反應器中，一株新的與Tetrasphaera相關的發酵細菌被鑒定為主要的聚磷菌。它們在利用碳源方面具有代謝的多功能性，包括但不限于乙酸酯、甘油和葡萄糖，而只有乙酸酯能有效地去除磷，并形成PHA作為儲存聚合物。當使用甘油和葡萄糖時，磷的吸收最小，這兩種有機物被轉化為糖原。甘油和葡萄糖發酵比多聚磷發酵提供更多的能量，但同時可能阻礙磷的釋放。在廢水EBPR中，發酵對Tetrasphaera聚磷菌的存活甚至優勢起著關鍵作用。這些發現擴大了我們目前對關鍵但研究較少的PAO組的的理解，將有助于更好地解釋它們在廢水除磷以及在全球磷生物化學循環中的作用。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acsestwater.3c00046

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