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抗體FC驗證應用實驗細胞染色步驟詳解

瀏覽次數:1538 發布日期:2023-4-10  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

一、細胞表面染色操作流程

①細胞計數

細胞計數:將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清。

②制備單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液。

③(可選)阻斷Fc受體

室溫孵育10-20min。

④一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min。

⑤洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑥二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8。

⑦ 洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑧重懸細胞

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。
 


 

二、細胞胞內染色操作流程

①細胞計數

將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清。

②制備單細胞懸液

將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液,400g離心5min去上清。

③固定

每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞,2-8°孵育20min。

④洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑤洗滌

每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞,室溫孵育20min。

⑥洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑦ (可選)阻斷Fc受體:

10-20min。

⑧一抗孵育

每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min。

⑨洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑩二抗孵育

對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11。

⑪洗滌

400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍。

⑫上機分析

用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。
 


 

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