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原生質體葉肉細胞瞬時表達實驗方法及步驟

瀏覽次數:2446 發布日期:2022-12-16  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
原生質體葉肉細胞瞬時表達
1、 生長培養好的試驗材料(一般為生長20天左右的擬南芥幼苗葉片)
2、 在擬南芥開花前取樣(30片葉子左右即可)
3、 切取葉片為0.5-1mm的細條(如果材料能達到每克107個原生質體, 10-20片葉子需要5-10mL酶解液)
4、 迅速將切下的樣品轉到酶解液中,要求完全浸沒。
5、 黑暗條件下抽真空30min。
6、 連續酶解,室溫下23℃黑暗中靜止酶解3h
7、 利用光學顯微鏡檢查原生質體(30-50μm大小)
8、 在過濾前加入等量的W5溶液
9、 洗干凈濾網,并用W5潤濕,之后過濾
10、 離心100g,1-2min沉淀原生質體,盡可能吸走上清,重復洗2 次
11、 重懸原生質體于W5中,保持在2*105個 /ml,冰浴30min。
12、 100g離心2min,盡可能吸走上清,利用MMG重懸,濃度約 2*105個/ml
13、 加入10μL質粒(1000ng-2000ng )于2ml離心管中
14、 加入100μL原生質體(2*104個),輕輕混勻。
15、 加110μL PEG solution,輕彈使充分混勻
16、 23℃室溫孵育30min。
17、 加400-440μL W5混勻,終止反應
18、 100g,2min 23℃離心,去上清,重復洗一次
19、 用1mL W5重懸原生質體并放入6孔板中培養
20、 20-25℃孵育16h以上
21、 取樣制片觀察

溶液配制:
1、 酶解液的配制(20ml)
 
試劑 終濃度 質量/g  
MES 20mM 0.08528 KOH調pH5.7
D-Mannitol 0.4M 1.45736
KCl 20mM 0.02982
macerozyme R-10 0.40% 0.08  
Cellulase R-10 1.50% 0.3  
55℃水浴10min,待冷卻后再加以下試劑
CaCl2·2H2O 10mM 0.029402  
BSA 0.10% 0.02  
       
W5溶液配制(500mL      
試劑 終濃度 質量/g  
MES 2mM 0.19524 KOH調pH5.7
NaCl 154mM 4.49988
CaCl2·2H2O 125mM 9.18825
KCl 5mM 0.186375
MMG配制(100mL      
試劑 終濃度 質量/g  
MES 4mM 0.078096 KOH調pH5.7
D-Mannitol 0.4M 7.2868
MgCl2·6H2O 15mM 0.30495
PEG配制(10mL      
試劑 終濃度 質量/g  
PEG 4000 40% 4  
D-Mannitol 0.2M 0.36434  
CaCl2·2H2O 100mM 0.14701
發布者:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
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