胰腺四周布滿了十二指腸和膽總管等高度血管化的器官。胰腺癌經常侵襲并轉移至周圍的器官以及更遠位置的器官，例如肝臟、腹膜、肺、大腦、腎臟和骨骼。傳統的化療加放療或疾病晚期的化療加靶向藥物治療可以延長患者的生存期。但是，即使腫瘤局限的患者中，也僅有40%左右的患者能夠達到5年的生存期。這就說明亟需為所有胰腺癌患者改善傳統和免疫療法。腫瘤細胞可以逃避治療并繼續生長。另外，腫瘤微環境中的基質細胞也是促使持續性腫瘤生長的關鍵支持土壤。了解腫瘤微環境中的所有細胞的免疫狀態對于理解腫瘤轉移和改進癌癥治療方法至關重要，尤其是免疫療法。

在本研究中，使用了數十個生物標志物研究胰腺導管腺癌（PDAC）組織中的腫瘤異質性。使用Cell DIVE^™超多標組織成像整體分析解決方案，數十個生物標志物可表征腫瘤微環境中的細胞異質性、細胞活性和細胞間的空間位置關系。我們檢查了腫瘤、基質各成分和免疫細胞對腫瘤微環境的影響。所使用的生物標志物組合可用于檢測腫瘤相關的基質成分和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、血管生成、腫瘤轉移、侵襲、炎癥、缺氧、代謝和免疫反應。我們發現這些異質性作用經常都是相互影響的。例如，腫瘤內一些分區會適應缺氧條件并因此導致區域內絕大多數細胞增殖失控。另外，這些缺氧區域缺乏免疫細胞。超多標組織全玻片成像支持對腫瘤微環境中的細胞活動進行空間分辨組織分析，包括對細胞間相互作用和組織免疫狀態的研究獲得全新的認識。

方法和材料
在本研究中，使用商業來源（Pantomics）獲得的胰腺導管腺癌的FFPE樣本。抗體經過了嚴格的標準驗證過程（Gerdes等，2013）以確保抗體的結合性能類似于組織一抗/二抗間接標記。本研究中使用了不同供應商提供的三十個生物標志物，均作為商業偶聯抗體或者自行偶聯。使用Leica Bond（徠卡生物系統）對玻片進行循環染色；在Cell DIVE上使用四通道+DAPI成像玻片，并對圖像進行自動化自發熒光移除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統開發的專利軟件拼接圖像進行導入、融合、可視化和分析。該軟件將于2023年上半年上市。

結果
使用Cell DIVE超多標組織成像分析整體解決方案，用30個生物標志物循環染色了一個PDAC FFPE切片，確定侵襲性腫瘤細胞的空間狀態。本研究中使用的標志物在空間上確定了腫瘤內的代謝和缺氧、凋亡、上皮間質轉化和免疫細胞狀態（圖1 A）。在使用全套30個生物標志物進行細胞分割后，一小部分生物標志物被用來對腫瘤的異質區域進行分類和空間表征（圖1B）。具體來說，缺氧標志物Glut1和兩個PanCK生物標志物區分出了葡萄糖攝取量增加的癌細胞，這是一個癌癥標志。通過這種方式，將腫瘤中侵襲性較強區域的細胞類型與侵襲性較弱區域或正常組織的細胞分開分析，可以減少異質性。量化各區域的免疫貢獻，常氧腫瘤和正常胰腺與缺氧腫瘤區域相比，缺氧區域的淋巴細胞和其他免疫細胞總體減少，盡管所有區域的細胞總數接近（圖1D）并顯示了代表性的表型圖像（圖1D底部）。

通過聚類分析無偏差性的確定了細胞亞群。聚類分析和降維顯示，與其他區域相比，缺氧腫瘤區域的該細胞群體較少（圖2）。與基于表型的免疫細胞計數類似，在缺氧腫瘤區域存在極少的淋巴細胞（圖2C聚類和UMAP）。有趣的是，幾個聚類顯示了具有明顯膠原沉積的癌癥相關成纖維細胞（CAFs）群體（圖2C；橙色方框）。此外，對空間聚類關系的分析清楚地確定了與CAF（腫瘤相關成纖維細胞）在同一空間鄰域中常見的細胞類型（圖2C；鄰域圖）。例如，聚類5（SMA+基質集群）和聚類8（免疫細胞；CD45+，膠原蛋白+）是聚類16（SMA+膠原蛋白+；ClAP1+）的共同鄰居，表明炎癥和腫瘤導致的結締組織增生通常與PDAC患者的不良生存結果有關²。

結論
我們的研究展示了使用Cell DIVE超多標組織成像分析整體解決方案對單個PDAC切片進行30種生物標志物的循環染色和成像。在腫瘤微環境中，結合使用超多標組織成像和單細胞分析可形成強大的功能，能夠在腫瘤的侵襲性區域詳細檢測單細胞生物標志物的表達。腫瘤微環境中的細胞外基質、和癌癥相關的成纖維細胞（CAF）的貢獻得到了空間上的確定。

未來的工作將會進一步確定PDAC中的細胞外基質、癌癥相關成纖維細胞（CAF）和炎癥成分。例如，除了C0L1A1之外，還可以探索其他膠原蛋白、纖連蛋白和SPARC，以及參與CAF浸潤和炎癥的其他因素。

重要的是，Cell DIVE超多標組織成像整體分析解決方案可以保留組織，生物標志物的表達可以繼續在同一組織切片上進行探索，并與研究中所有先前染色的生物標志物重疊。表征腫瘤侵襲性區域的腫瘤微環境有助于闡明導致患者預后不佳的新機制，并有助于發現新的干預措施以提高未來治療PDAC的成功率。

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參考文獻：