姍姍來遲的世界杯，總算給朋友圈提供了第二談資。32支球隊，有傳統強隊，也有后起之秀。為了捧起大力神杯，各家紛紛使出十八般武藝。這種熱鬧場面，好比盛況空前的生物制藥市場。Me-Too和Me-Better都講究速度與激情，抓住工藝的CPP，才能俘獲CQA的芳心。

今天小編就從時下熱點——質粒 入手，分享上下游工藝中的“捧杯”秘籍。

質粒DNA應用

細胞和基因治療技術已成為生物醫藥領域最近幾年的新熱點，同時帶動了相關生物技術和產業的蓬勃發展。質粒DNA，既可以作為核酸疫苗或核酸藥物單獨使用，也可作為mRNA藥物生產中的模板材料，還可以在重組病毒載體生產中作為病毒包裝的原料。隨著細胞和基因治療、mRNA藥物的飛速發展，質粒DNA的需求與日俱增。因此，制備高純度、高質量的超螺旋DNA，始終是細胞和基因治療領域企業的重要工作目標。

質粒DNA生產工藝流程圖（經典三步法）
 
質粒DNA生產流程

1   大腸桿菌發酵
發酵主要是在感受態選擇、培養基、培養方式、營養物質、溶氧、pH、溫度等方面進行優化。質粒的擴增得益于大腸桿菌規模化高密度發酵來實現，如何進行高密度發酵，并在有限的發酵液中得到高質量的質粒DNA，減少下游純化壓力，是上游發酵需要持續解決優化的方向。

2  菌體收集
發酵結束，通常采用離心的方式收集菌體。考慮中試放大的可行性，規模化生產建議采用中空纖維切向流過濾收菌的方式，推薦使用750KD或0.1、0.2μm的中空纖維。

3  菌體裂解
最經典裂解工藝還是三步堿裂解法，重懸（50mM Glucose，25mM Tris，10mM EDTA ，pH 7.5~8.0）→堿裂解（0.2 M NaOH ，1% SDS）→中和（3M 乙酸鉀， 2M CH3COOH pH 5.0）。小試階段通常采用手動操作，由于手動操作的不確定性及不可放大性，會出現不同批次裂解效果不同的差異，中試放大后，存在裂解效率降低，開環占比增加的風險；因此保證產品中試階段高質量的穩定性，批次間一致性，也是工藝人員需要考慮的重點。

4  澄清
裂解中和后的液體，存在很多固體雜質，需要澄清后才能進行下一步工序。通常選擇嚢式濾器或深層濾器過濾澄清。

5  超濾濃縮
澄清后上清液通常采用50KD或100KD的切向流超濾膜組件進行合理的濃縮和洗濾，以達到方便下一步層析純化的要求。在大規模質粒生產時，需要提高工藝可放大性和合規性。其中，材質和孔徑選擇、TMP優化和剪切力是比較關鍵的地方。

6  層析純化
6.1 凝膠過濾層析
使用百林科Chromstar 6FF純化，此過程工藝目的是去除RNA。在合適的鹽濃度下，質粒和RNA分子大小差異最大。樣品流經層析柱，質粒先出，RNA后出，從而實現分離。上樣量在0.1~0.25CV之間，推薦上樣線性流速60 cm/h，工藝放大柱高建議30±5 cm，具體參數條件建議客戶根據實際工藝情況進行摸索。

Buffer A：2.1M (NH4)₂SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
 

結果：Chromstar 6FF 柱純化后，質粒與RNA有效分離。

6  層析純化
6.2 親和層析
此步驟工藝目的去除開環質粒等雜質。百林科MaXtar PlasmidCap HR填料能夠特異性的結合超螺旋質粒，載量達到2mg/ml。樣品流經層析柱，在合適工藝條件下，開環質粒流穿，超螺旋質粒結合在填料上，經洗脫收集，從而實現超螺旋質粒和開環質粒的高效分離，此層析步驟還有去除HCD的能力。

典型Buffer推薦如下：

• Buffer A: 2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
• Buffer B: 1.7M (NH4)2SO4，0.3M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl pH 7.5

 

結果：MaXtar PlasmidCap HR填料純化質粒樣品可實現對開環質粒和超螺旋質粒的完全分離，超螺旋質粒純度可以達到90%以上。
 
6  層析純化
6.3 離子交換層析
經過Chromstar 6FF和MaXtar PlasmidCap HR純化后的超螺旋質粒的內毒素含量已經很低，經過MaXtar Q HR進一步純化，可以有效將內毒素控制在合格范圍內。

典型Buffer推薦如下：
Buffer A：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
Buffer B：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
 

結果：經MaXtar Q HR填料純化后，回收率＞85%，內毒素含量＜10EU/mg。
 
* 根據超螺旋質粒含量計算

7  濃縮換液
純化后超螺旋質粒經過UF/DF調整濃度及置換緩沖液，除菌過濾，儲存備用。

質粒三步法的工藝優勢

層析三步法已廣泛應用于不同領域，適合建立平臺化的質粒純化方案，以減少工藝開發工作量。相較于其他質粒工藝路線，適用于不同大小分子范圍，面對不同質粒的上游表達量，RNA等雜質含量以及發酵的批間差異，能夠最大程度保證產品質量，平臺通用性較強，優勢明顯。
與此同時，百林科也可以根據客戶不同應用的質量需求定制開發純化路線。

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