利用三組學(xué)聯(lián)合分析揭示多軸的抑癌機制
鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生率約占頭頸部惡性腫瘤的90%，而口腔鱗狀細(xì)胞癌是全球頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的主要類型，但這些惡性腫瘤的分子機制尚不清楚。因此，識別與口腔和食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機制相關(guān)的未知危險因素，將為預(yù)防和治療這些惡性腫瘤提供有效的治療策略。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院劉芝華教授團隊在Cell Reports（IF 9.995）發(fā)表了題為“OTUB2 exerts tumor-suppressive roles via STAT1-mediated CALML3 activation and increased phosphatidylserine synthesis”的研究論文，該研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)以及分子生物學(xué)實驗驗證，揭示了OTUB2/STAT1/CALML3/PS軸具有抑癌作用，并顯示了PS（phosphatidylserine，磷脂酰絲氨酸）給藥作為治療和預(yù)防上消化道鱗狀細(xì)胞癌的策略的潛力。其中，中科新生命提供了轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組的檢測和技術(shù)支持服務(wù)。
研究材料
鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型、OTUB2敲除鱗狀細(xì)胞癌小鼠模型、人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系
技術(shù)路線
步驟1：OTUB2在正常食管上皮及食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)檢測
步驟2：多組學(xué)聯(lián)合分析揭示CALML3是介導(dǎo)OTUB2抑癌功能的關(guān)鍵下游基因
步驟3：OTUB2/CALML3軸激活Ca2+信號通路，促進PS的合成
步驟4：OTUB2是通過介導(dǎo)STAT1的泛素化修飾影響磷酸化，激活CALML3轉(zhuǎn)錄
步驟5：臨床前研究提示口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生
步驟2：多組學(xué)聯(lián)合分析揭示CALML3是介導(dǎo)OTUB2抑癌功能的關(guān)鍵下游基因
步驟3：OTUB2/CALML3軸激活Ca2+信號通路，促進PS的合成
步驟4：OTUB2是通過介導(dǎo)STAT1的泛素化修飾影響磷酸化，激活CALML3轉(zhuǎn)錄
步驟5：臨床前研究提示口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生
研究結(jié)果
1、OTUB2抑制上消化道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生
為了研究OTUB2在上消化道鱗狀細(xì)胞癌中的功能，作者首先檢測了其在正常食管上皮及食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中的表達(dá)情況，相較于ESCC組織，OTUB2在正常食管上皮中高表達(dá)，且預(yù)后分析表明OTUB2高表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后更好。于是，作者構(gòu)建了一個OTUB2敲除ESCC小鼠模型，OTUB2敲除ESCC小鼠中發(fā)生舌瘤結(jié)節(jié)數(shù)量及ESCC發(fā)生率明顯高于野生型ESCC小鼠。接下來，作者將OTUB2敲除的上皮細(xì)胞系異種移植到小鼠體內(nèi)，觀察OTUB2敲除是否可以促進人鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OTUB2沉默的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出較強的致癌能力，進一步驗證了OTUB2在上消化道鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的抑癌作用。
圖1 OTUB2腫瘤抑制作用
2、 多組學(xué)聯(lián)合分析揭示CALML3是介導(dǎo)OTUB2抑癌功能的關(guān)鍵下游基因
作者通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析，探討OTUB2腫瘤抑制機制。聯(lián)合分析顯示11個基因的mRNA水平和蛋白水平表現(xiàn)出一致的上調(diào)或下調(diào)，其中，CALML3被選擇進行進一步研究，因為據(jù)報道它在口腔和皮膚鱗狀細(xì)胞癌中下調(diào)，并作為區(qū)分肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌的重要標(biāo)志物。在SCC細(xì)胞中過表達(dá)OTUB2后腫瘤的生長受到抑制，且過表達(dá)OTUB2后CALML3 mRNA和蛋白水平持續(xù)升高，而CALML3敲低消除了OTUB2對腫瘤發(fā)生的抑制。這些結(jié)果證實了CALML3是介導(dǎo)OTUB2腫瘤抑制功能的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子。
圖2 OTUB2通過激活CALML3來抑制SCC
3. OTUB2/CALML3軸通過控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平來調(diào)節(jié)PS的合成
為了確定OTUB2/CALML3抑制腫瘤作用的下游事件，對轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行了KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)幾種脂質(zhì)代謝途徑顯著富集。于是作者對小鼠腫瘤組織進行脂質(zhì)組學(xué)分析，在OTUB2和CALML3表達(dá)組中甘油磷脂顯著增加，其中磷脂酰絲氨酸（PS）最為顯著，提示這可能是介導(dǎo)OTUB2抑癌功能的關(guān)鍵代謝事件。
鈣調(diào)素是一種多功能的Ca2+感應(yīng)蛋白，通過調(diào)節(jié)靶蛋白來控制各種細(xì)胞事件。CALML3與鈣調(diào)素有85%的同源性，作者預(yù)測CALML3與鈣調(diào)素一樣，可通過感應(yīng)Ca2+水平調(diào)節(jié)離子通道。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OTUB2或CALML3顯著增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，用Ca2+通道抑制劑處理細(xì)胞后，完全消除了OTUB2或CALML3過表達(dá)引發(fā)的PS合成升高，證明OTUB2/CALML3軸通過控制細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平來調(diào)節(jié)PS的合成。
圖3 OTUB2/CALML3增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和甘油磷脂的合成
4.STAT1是介導(dǎo)OTUB2對CALML3轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
OTUB2通過激活CALML3來抑制SCC，然而，OTUB2本身的蛋白結(jié)構(gòu)沒有作為轉(zhuǎn)錄因子的特點，因此作者進一步通過質(zhì)譜鑒定，鎖定了STAT1是介導(dǎo)OTUB2對CALML3轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。
泛素化實驗證實STAT1是去泛素化酶OTUB2的直接底物，且OTUB2對STAT1的去泛素化修飾在不影響其蛋白穩(wěn)定性的情況下促進了STAT1的Tyr701位點磷酸化修飾及進一步的二聚體形成。這些結(jié)果揭示了去泛素化修飾、磷酸化對轉(zhuǎn)錄因子STAT1活性的調(diào)控，隨后增強CALML3的轉(zhuǎn)錄激活。
圖4 OTUB2介導(dǎo)STAT1的泛素化修飾影響磷酸化
5. 口服PS可抑制腫瘤的干細(xì)胞性來阻止鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生
PS是細(xì)胞膜的功能成分，是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。PS在肉、腦組織、大豆和其他內(nèi)臟器官中含量豐富。外源性PS可以跨越血腦屏障，并已被證明可以改善記憶力、注意力和學(xué)習(xí)能力。PS已被批準(zhǔn)為世界范圍內(nèi)的食品補充劑，健康補充劑。然而，補充PS是否發(fā)揮抗癌作用仍不清楚。為了進一步驗證口服PS對上消化道鱗狀細(xì)胞癌的抑制功能，作者利用鱗狀細(xì)胞癌人源腫瘤組織異種移植模型進行了臨床前研究，并發(fā)現(xiàn)口服PS顯著抑制了OTUB2低表達(dá)鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生以及增強了其對化療藥物的敏感性。這些數(shù)據(jù)證明了口服PS的靶向作用，為后續(xù)進一步探索應(yīng)用PS預(yù)防及治療人類惡性腫瘤提供了重要的前期基礎(chǔ)。
圖5 口服磷脂酰絲氨酸抑制上消化道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生
結(jié)論
本文章利用多組學(xué)整合分析系統(tǒng)的研究了OTUB2在上消化道鱗狀細(xì)胞癌中的重要抑癌功能，并發(fā)現(xiàn)該功能是通過促進轉(zhuǎn)錄因子STAT1的磷酸化及二聚體形成進而激活CALML3轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)的。其中磷脂酰絲氨酸合成增加是介導(dǎo)OTUB2抑癌功能的關(guān)鍵代謝事件，并且臨床前研究結(jié)果提示口服磷脂酰絲氨酸可能會為抑制上消化道鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生帶來幫助。
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