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利用熒光法檢測蛋白濃度的兩種方式

瀏覽次數:3782 發(fā)布日期:2022-11-4  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

蛋白質定量是許多蛋白質生物學工作流程的重要組成部分,是蛋白質電泳、蛋白質印跡、質譜和免疫分析等常用技術之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比,熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準確性更高。


蛋白質定量是許多蛋白質生物學工作流程的重要組成部分,是蛋白質電泳、蛋白質印跡、質譜和免疫分析等常用技術之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比,熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準確性更高。


試劑及儀器
• Qubit™ Protein Assay Kits(Thermo:Q33212)
• Qubit 4熒光計(Thermo)
• Fluo-200熒光計(奧盛)
• Feyond-A300多功能酶標儀(奧盛)

方法
• 標品配置

加樣體積 10μL
標品配制 將試劑盒中最高濃度的400ng/uL蛋白標品稀釋配制成300、200、100、50、25、12.5ng/uL共6個濃度,試劑盒濃度范圍在12.5 µg/mL 到 5 mg/mL。 


• 操作步驟
1.根據試劑說明書,制備染料Mix工作液及0、200及400ng/uL校準點試劑,校準曲線完成后,分別在Qubit4與Fluo-200上進行檢測;

2.在96孔黑色平底微孔板的每孔中加入10uL標品溶液后,每孔中再添加190uL的Mix工作液,混勻后避光5分鐘,開始儀器檢測,標品與空白布局如圖1,儀器參數如表1。
 
表1 Feyond-A300參數 
 
試劑波長 EX/EM:470/525
PMT增益 中低
穩(wěn)定時間 150ms
積分時間 40μs


圖1. 樣品布局界面

結果
1.利用Feyond-A300的內置數據處理軟件,將蛋白標品濃度與熒光強度進行標準曲線擬合,采用四參數(4PL)擬合方式,得到曲線方程與曲線擬合度,R2接近為1(圖2)。 
 
         
圖2. 蛋白標準曲

2.濃度范圍在12.5 ng/uL~400ng/uL時,Fluo-200與Qubit4的檢測濃度偏差均在10%以內,是Qubit的合理偏差。除接近極限濃度的最低點外,Feyond-A300的檢測濃度與Qubit4相比也在合理偏差內,且與理論濃度更為接近(表2)。

表2 三款儀器的檢測數據
 
理論濃度 Qubit4 Fluo-200 Feyond-A300
12.5 20 19.11 8.023
25 33.2 30.59 29.319
50 50.6 46.16 50.626
100 95.2 92.94 101.835
200 184 192.39 197.206
300 286 299.71 302.978
400 400 401.22 398.596

總結
Qubit 熒光檢測蛋白試劑盒,不僅在Qubit儀器上可以適用,也可在Feyond-A300的熒光檢測功能上適用,并且準確性基本無差異,熒光計檢測無需建立標準曲線,僅需進行標品點的校準,便可直接進行濃度的測試,簡單便捷。Feyond-A300的標曲保存功能,亦可滿足該需求,僅需一次建立標曲后,將標曲保存于標曲庫,后續(xù)僅需調取該標曲便可直接給出未知樣品的濃度。
 
發(fā)布者:杭州奧盛儀器有限公司
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