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生物反應器助力枯草芽孢桿菌高效合成D-阿洛酮糖

瀏覽次數:1691 發布日期:2022-9-16  來源:迪必爾生物


D-阿洛酮糖是一種低熱量、高甜度的己糖單糖。然而D-阿洛酮糖制備過程在堿性和高溫條件下,非酶引發的褐變阻礙了D-果糖至D-果膠的轉化,并且產生的副產物增加了分離和提取的難度。


為了解決生產過程中的上述問題,江南大學饒志明課題組發表的研究Efficient D-allulose synthesis under acidic conditions by auto-inducing expression of the tandem D-allulose 3-epimerase genes in Bacillus subtilis中在構建的枯草芽孢桿菌168(Bs168)內利用D-阿洛酮糖3-差向異構酶(DPEases)基因表達和自動誘導啟動子工程,在酸性條件下有效合成D-阿洛酮糖。

實驗首先選擇枯草芽孢桿菌168作為DPEases異源表達底盤細胞,分別表征了pH和溫度對純化酶活性和穩定性的影響。純化酶PSDPEase受溫度變化影響顯著,RCDPEase則具有更好的熱穩定性。RCDPEase的活性受到pH變化的顯著影響,而DSDPEase的活性受到的影響較小。然而當使用DSDPEase催化果糖合成D-阿洛酮糖時,發現反應混合物發生非酶褐變,并隨著pH逐漸變為堿性會越來越明顯。

 

DPEases酶學性質和堿性條件下的非酶褐變
 

溫度和pH都會影響非褐變過程。較高的溫度有利于加速反應,提高生物轉化過程中的轉化率。實驗設計研究pH對消除非酶促褐變反應的影響。結果表明,單一酶在酸性條件下活性遠低于堿性條件下的活性。
 

DPEase合成D-阿洛酮糖和DPEase在一個細胞共表達的平衡時間
 

進一步基于雙順反子表達系統,對來自不同菌株兩個具有互補功能特征的DPEase在一個細胞中在啟動子HpaII下串聯表達。結果表明組合表達DPEase可以提高催化效率,弱酸(pH 6.5)條件下酶活性需要進一步提高。

為了提高DPEase的表達水平,實驗通過自動誘導啟動子工程優化啟動子。結果證實啟動子優化促進了DPEase的表達。由于不同啟動子在菌株中的表達機制不同,受生長時間、環境和營養等多種因素影響。因此對得到的菌株在5-L生物反應器(T&J Bio-Engineering, Shanghai)中進行分批補料培養以測試總酶表達的活性。

啟動子表達對酶活性的影響
 

發酵過程中DO通過攪拌自動控制,保持DO在30%。生物量在起初6h內迅速增加,pH由于蔗糖的消耗而上升,此時連續補料。隨后細胞密度以2-3 OD600的速度增加,細胞密度增加到98.8,30h酶活性為387.7 U/mL。生長進入穩定期后,36h細胞密度不再增加,酶活性仍然不斷增加。當重組菌株培養至42h時,酶活性高達到480.1 U/mL。此結果比先前報道的研究結果高11倍。

與游離酶催化相比,全細胞轉化可以消除細胞破壞和純化的步驟,更加利于工業生產。實驗通過細胞密度和底物濃度優化催化的過程。在OD600=15,500 g/L果糖濃度是更加優化的全細胞轉化條件。獲得的產物產率高達163.5 g/L。

全細胞生物轉化條件優化
 

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參考文獻:Hu M, Wei Y, Zhang R, Shao M, Yang T, Xu M, Zhang X, Rao Z. Efficient D-allulose synthesis under acidic conditions by auto-inducing expression of the tandem D-allulose 3-epimerase genes in Bacillus subtilis. Microb Cell Fact. 2022 Apr 19;21(1):63. doi: 10.1186/s12934-022-01789-2. PMID: 35440084; PMCID: PMC9019997.


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