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Trizol法提取總RNA的流程及原理

瀏覽次數(shù):2227 發(fā)布日期:2022-9-13  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
提取原理:Trizol試劑的主要成分是苯/酚。苯/酚的主要作用是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解,從而使細(xì)胞當(dāng)中的蛋白質(zhì)以及核酸物質(zhì)解聚而得以釋放。苯/酚雖然可以有效的使蛋白質(zhì)變性,但它不能完全抑制RNA酶的活性,因此Trizol中還加入了8-羥基喹/啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase(即RNA酶)。

Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品的裂解液或勻漿中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯/仿(CHCl3)后離心,樣品能分成水樣層和有機(jī)層。而RNA存在于水樣層中。在收集上面的水樣層后,RNA可以通過異丙醇沉淀的方法來還原。在除去水樣層之后,樣品中的核酸和蛋白也能相繼以沉淀的形式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,在有機(jī)層中加入異丙醇能析出有機(jī)層的蛋白。

Trizol試劑不但可用于小量樣品(組織:50-100mg;細(xì)胞:5×106),也可用于大量樣品(組織≥1g或細(xì)胞≥107),對(duì)動(dòng)物、植物、細(xì)菌、血液提取都適用,可同時(shí)處理大量不同樣品。反應(yīng)迅速,提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)污染,可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保護(hù)分析等。

RNA純化要求:
1.純化后不應(yīng)存在對(duì)酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)有抑制作用的物質(zhì)。
2.排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染。
3.蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降到最低程度。
4.排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事項(xiàng):
1.杜絕外源酶的污染。
(1)嚴(yán)格戴好口罩,手套。
(2)實(shí)驗(yàn)涉及的離心管,Tip頭,移液器桿,電泳槽,實(shí)驗(yàn)臺(tái)面等要徹底處理。
(3)實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液,尤其是水,必須確保RNase-Free。

2.阻止內(nèi)源酶的活性。
(1)選擇合適的勻漿方法。
(2)選擇合適的裂解液。
(3)控制好樣品的起始量。
發(fā)布者:上海聯(lián)碩生物科技有限公司
聯(lián)系電話:400 0918 500
E-mail:lianshuo@vip.126.com

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