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生物反應(yīng)器在生物工程肝臟器官體外培養(yǎng)研究中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):1301 發(fā)布日期:2022-9-1  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負


急性和慢性肝功能衰竭肝臟移植是唯一治療方法,供體器官卻面臨持續(xù)短缺的情況。器官生物工程技術(shù)有希望利用生物反應(yīng)器體外培養(yǎng)制造人體器官來解決這一困境。然而,該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用目前還受到功能血管網(wǎng)絡(luò)重建、特定功能細胞移植、細胞系培養(yǎng)條件不同等重重阻礙。
 

Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs報告了一種將HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)重新內(nèi)皮化后,原代豬肝細胞植入生物工程肝臟(BEL)支架,利用生物反應(yīng)器進行體外培養(yǎng)增殖器官細胞獲得生物工程肝臟的方法。


去細胞支架制備

首先,使用Triton X-100和SDS洗滌劑溶液分別灌注豬肝臟以獲得無細胞支架。組織學(xué)染色驗證去細胞化支架中完全去除細胞物質(zhì)并只保留細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白膠原I和膠原IV。隨即將去細胞化的肝臟安裝在生物反應(yīng)器中,并用不含抗生素的內(nèi)皮培養(yǎng)基灌注72小時(37°C,5%二氧化碳)。
 

人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)與支架接種

人臍靜脈內(nèi)皮細胞同樣在不含抗生素內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基中進行預(yù)處理(37°C,5%二氧化碳),隨即接種進行培養(yǎng)。首先靜態(tài)培養(yǎng)1小時,使得細胞先附著在支架上,隨后灌注補充含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基。每天更換培養(yǎng)基,確保生物反應(yīng)器內(nèi)葡萄糖水平在24小時內(nèi)保持在0.3 g/L以上。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基灌注壓力保持在12 mmHg。


豬肝細胞分離、培養(yǎng)與支架接種

新鮮豬肝臟去除殘留血液和經(jīng)缺血性損傷預(yù)防性處理后,使用膠原酶和中性蛋白酶進行酶解。使用含10% FBS(胎牛血清)的Williams E溶液進行細胞分散,經(jīng)過篩分離、離心富集得到肝細胞,并在2L培養(yǎng)基中進行高密度培養(yǎng)(1X106細胞/mL)。HUVEC接種至支架的13-16天后,以50 mL/min的速率利用蠕動泵將含有肝細胞的培養(yǎng)基灌注至反應(yīng)器內(nèi)。接種48h后,觀察到肝細胞在支架上呈簇狀分布。


反應(yīng)器培養(yǎng)細胞代謝物與分泌因子分析

每天收集來自生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基樣品,進行離線分析確定培養(yǎng)基中葡萄糖,氨和乳酸脫氫酶活性的水平。測量葡萄糖濃度用于計算24小時內(nèi)的消耗。使用ELISA試劑盒定量可溶性和白蛋白。
 

經(jīng)組織學(xué)分析、氨清除動力學(xué)分析和尿素生產(chǎn)測定后,證實培養(yǎng)所得到的生物工程肝臟能夠產(chǎn)生白蛋白、氨解毒和尿素合成,具有肝臟器官類似的功能。實驗證實了肝細胞高密度培養(yǎng)的可行性,并在去細胞化肝支架中可以保持其器官功能。此外,數(shù)據(jù)顯示在支架中培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞在體外不會阻礙支架中肝細胞的功能。


生物工程肝臟還可以用于減緩手術(shù)誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭模型中氨的積累。該研究結(jié)果證實了設(shè)計生產(chǎn)臨床規(guī)模BEL可行性,并建立了一個優(yōu)化肝臟特異性細胞接種和植入的生物培養(yǎng)平臺。

 

參考文獻:

1. Anderson, B.D., Nelson, E.D., Joo, D. et al. Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs. Commun Biol 4, 1157 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02665-2

 

 

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