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利用HTRF技術檢測總蛋白和磷酸化蛋白水平

瀏覽次數:1926 發布日期:2022-8-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

多種疾病的產生都伴隨著蛋白過度磷酸化的機制。研究磷酸化水平,以確定信號傳導。在不評估總蛋白磷酸化和非磷酸化水平的情況下,研究人員可能會得出錯誤的結論,即一種化合物具有上調或下調磷酸化的作用,而實際上其作用可能是由于該蛋白質表達水平的變化。這種錯誤的分析結果導致對化合物的功能的判定。


HTRF®--均相時間分辨熒光,時間分辨(TRF)和熒光共振能量轉移(FRET)兩大核心技術的碰撞,利用兩個極其穩定的熒光基團,“相遇即發光”的原理,提供了一個簡單(免洗),快速,高通量,高靈敏的方法分析磷酸化蛋白和總蛋白水平。


HTRF分析總蛋白和磷酸化蛋白
本研究進行了總AKT和磷酸化AKT Ser473檢測,由此提供總蛋白檢測重要性的依據。

 

 


實驗方法:所有檢測方法均采用標準的貼壁細胞雙板HTRF檢測方法進行。細胞與化合物在96孔板中孵育,裂解細胞,轉移到兩個不同的檢測板上,一個用于測量磷酸化AKT,另一個用于測量總AKT,并添加HTRF試劑進行檢測。



HEK293細胞用于100000個細胞/孔的所有AKT檢測。細胞與不同濃度的IGF-1孵育10分鐘;已知的蛋白質合成抑制劑環己胺,孵育16小時。數據均以HTRF Ratio值和歸一化值表示。


用IGF-1處理細胞以劑量依賴的方式顯著增加了AKT Ser473磷酸化水平,EC50值為1.06nM。IGF-1也下調了AKT的表達,半抑制濃度值為0.8nM。使用兩種分析數據計算的歸一化值P-AKT/T-AKT顯示,在IGF-1刺激下,磷酸化的AKT與非磷酸化的AKT的比例顯著增加。

 


環己酰亞胺處理AKT磷酸化水平降低,且AKT表達水平降低,且半抑制濃度值相似。如果沒有進行總AKT檢測,并且只評估磷酸化AKT檢測結果,那么環己酰亞胺可能被錯誤地定義為AKT磷酸化的抑制劑。通過進行兩種分析和將數據表示為歸一化值,可以發現,AKT的磷酸化水平不受環己酰亞胺處理的調節。因此,環己酰亞胺可以被正確地識別為AKT表達的抑制劑,其半抑制濃度值為460nM,但它并不抑制磷酸化。

 


結合上述實驗結論,可以幫助我們進一步了解同時檢測磷酸化蛋白和總蛋白的重要性,正確并客觀的認定化合物對蛋白磷酸化水平的調節。
 

*同靶點有500test和10000test可提供。小編還有AlphaLISA技術磷酸化蛋白和總蛋白檢測試相關試劑盒可提供,詳情請咨詢優寧維。

HTRF®需要使用搭載有相應模塊的酶標儀進行讀值,優寧維推薦PerkinElmer VICTOR Nivo™ 多功能酶標儀:

 

發布者:上海優寧維生物科技股份有限公司
聯系電話:4008-168-068
E-mail:hezq@univ-bio.com

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