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Zeno SWATH DIA新技術(shù)二:皮克級(jí)超低上樣量的穩(wěn)定蛋白質(zhì)組鑒定及定量

瀏覽次數(shù):1363 發(fā)布日期:2022-7-21  來(lái)源:SCIEX
ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)配備的Zeno Trap(Zeno阱)功能激活后,可以使SWATH DIA工作流程中的肽段二級(jí)質(zhì)譜靈敏度提高5-6倍左右,使得蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程平臺(tái)中使用納克甚至皮克級(jí)樣品量成為可能。我們應(yīng)用Zeno SWATH IDA流程,對(duì)低進(jìn)樣量K562樣品進(jìn)行分析,使用納升液相系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量測(cè)試,并且評(píng)價(jià)了DIA-NN中使用基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)和非自建庫(kù)的分析流程。
 
  • 液相方法:液相系統(tǒng):M Class系統(tǒng)(Waters),色譜柱:EV-1106 色譜柱,15 cm x 150 μm,1.9 μm 粒徑,流速:300 nL/min,梯度:45min。
  
  • 質(zhì)譜方法:質(zhì)譜:ZenoTOF™ 7600系統(tǒng),采集模式:Zeno SWATH DIA,可變窗口數(shù):80個(gè)(m/z 400-903),一級(jí)累積時(shí)間:50毫秒,二級(jí)累積時(shí)間:18毫秒,源氣參數(shù):離子源電壓3200 V,溫度225°C,Gas1 :10 psi ,CUR gas :20 psi。
 
  • 數(shù)據(jù)分析:Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA- NN軟件處理,分別使用自建數(shù)據(jù)庫(kù)和非自建庫(kù)流程,自建數(shù)據(jù)庫(kù)為之前由OneOmics建立的人細(xì)胞裂解液數(shù)據(jù)庫(kù)。
 
 
主要結(jié)果:

1.  低進(jìn)樣量時(shí)蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量

在不同進(jìn)樣量時(shí)測(cè)試蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量,可以看到在250 pg進(jìn)樣量時(shí),K562樣品可以鑒定到880個(gè)蛋白質(zhì)( FDR<1%),其中327個(gè)蛋白質(zhì)CV低于20% ( 圖1)。隨著樣品進(jìn)樣量的增加,蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量增加,進(jìn)樣5ng時(shí)鑒定出3752個(gè)蛋白( FDR<1%),其中2457個(gè)蛋白CV低于20%。空白樣品按照相同條件進(jìn)行分析,未檢測(cè)到蛋白或多肽,說(shuō)明工作流程可靠性。
 
  
圖1. 不同低進(jìn)樣量樣品中蛋白質(zhì)(左)
和肽段(右)的鑒定和定量數(shù)量
 
左圖透明柱狀圖代表global FDR<1%時(shí)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量,實(shí)心柱狀圖代表FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)量。
 
 
2.  采用自建數(shù)據(jù)庫(kù)和非自建庫(kù)時(shí)蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量對(duì)比

使用DIA-NN分別進(jìn)行基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)處理,以及直接從人類FASTA文件中生成理論數(shù)據(jù)庫(kù)的分析。總體而言,兩種數(shù)據(jù)處理方法蛋白質(zhì)鑒定的重疊程度很高,使用自建數(shù)據(jù)庫(kù)處理的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量略多(約4%)(圖2),二者共同鑒定到的蛋白質(zhì)為819個(gè)。
 

圖2. 使用數(shù)據(jù)庫(kù)與非數(shù)據(jù)庫(kù)分析流程中
蛋白質(zhì)鑒定數(shù)的對(duì)比
 
 
3.  Zeno SWATH IDA流程穩(wěn)定性測(cè)試

通過(guò)比較間隔1個(gè)月進(jìn)樣的2組實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估低進(jìn)樣量實(shí)驗(yàn)的日間重復(fù)性,每次實(shí)驗(yàn)對(duì)相同的K562原液進(jìn)行稀釋,使用Zeno SWATH DIA進(jìn)行分析。可以看到,在3種低進(jìn)樣量下,觀察到相近的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量(圖3)。
 

圖3. 用獨(dú)立稀釋的K562樣品進(jìn)行不同時(shí)間的比較
 
兩組實(shí)驗(yàn)中,每個(gè)進(jìn)樣量樣品均進(jìn)行3次采樣。數(shù)據(jù)在DIA-NN軟件中使用基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)的流程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。透明柱狀圖表示global FDR <1%的蛋白質(zhì)鑒定數(shù),實(shí)心柱狀圖帶表示FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白質(zhì)數(shù)。
 

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