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Zeno SWATH DIA新技術(shù)一:納升流速下的高靈敏度蛋白質(zhì)組鑒定和定量

瀏覽次數(shù):1249 發(fā)布日期:2022-7-21  來源:SCIEX
 
納升液相系統(tǒng)因具有非常高的靈敏度,常用于蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程中,特別是當(dāng)可用樣品量非常低的時候。高質(zhì)量的色譜分離對于蛋白質(zhì)鑒定很重要,因為良好的峰形和分離可以減少離子抑制,并允許質(zhì)譜系統(tǒng)采樣盡可能多的特異性肽段。
 
 
在本研究中,我們結(jié)合使用納升液相系統(tǒng)與Zeno SWATH DIA流程,以評估ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)使用納升系統(tǒng)時蛋白鑒定和定量的能力。

液相方法:液相系統(tǒng):NanoLC 425系統(tǒng)(SCIEX),色譜柱:核殼Biozen 5 μm Peptide XB-C18 (0.075 x 500 mm, 5 μm, P/N 00j -4792- w - sx),流速:400 nL/min,梯度:60min。

質(zhì)譜方法:質(zhì)譜:ZenoTOF™ 7600系統(tǒng),離子源:OptiFlow Turbo V離子源,采集模式:Zeno SWATH DIA,可變窗口數(shù):100個,累積時間:25毫秒,二級MS/MS模式下啟用Zeno Trap(Zeno阱),樣品采集三份平行數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析:Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)使用DIA- NN軟件處理,分別使用自建庫和非自建庫流程,數(shù)據(jù)庫為之前由OneOmics生成的人細(xì)胞裂解液數(shù)據(jù)庫。
 
 
主要結(jié)果:

1.不同進樣量時蛋白質(zhì)鑒定和定量測試

我們使用K562細(xì)胞裂解液樣品,在1小時的液相梯度中,使用Zeno SWATH DIA采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),在DIA-NN中采用自建庫分析,發(fā)現(xiàn)隨著上樣量的增加,蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)也增加了(圖1)。在三次重復(fù)實驗中,確定FDR <1%,CV <20%的定量蛋白質(zhì)數(shù)量。當(dāng)柱上進樣200 ng樣品時,鑒定蛋白質(zhì)約6800個,可定量蛋白質(zhì)約6300個(92%)。
 

圖1. 不同進樣量時蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量
 
對比不同進樣量時定量到的FDR <1%,CV <20%肽段,可以看到隨著進樣量增加,60min納升流速梯度中鑒定(空心標(biāo)志)和定量(實心標(biāo)志)的肽段數(shù)量也在增加(圖2)。在100 ng進樣量時,約67,000個肽段被鑒定到,其中約80%被定量到。
 

圖2. 不同進樣量時肽段鑒定和定量數(shù)量

2.數(shù)據(jù)分析時使用自建數(shù)據(jù)庫和非自建庫對比

我們使用DIA-NN軟件對比了相同Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)在使用自建數(shù)據(jù)庫和不使用自建庫時,蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量的區(qū)別。自建數(shù)據(jù)庫方法中使用的數(shù)據(jù)庫為之前通過DDA鑒定建立的人細(xì)胞裂解液數(shù)據(jù)庫;非自建庫方法中使用的為從人FASTA文件中生成的理論數(shù)據(jù)庫。在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定和定量中,兩個方法所得到的結(jié)果非常相似。此外,使用另外一個理論公共數(shù)據(jù)庫Pan human數(shù)據(jù)庫時,Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)也能得到類似的結(jié)果(圖3左上及右上)。

為了進一步測試非自建庫方法的保真度,對使用理論數(shù)據(jù)庫與DDA自建庫中分別鑒定到的蛋白質(zhì)進行對比。維恩圖(圖3,下)顯示,這些方法可以得到非常接近的結(jié)果,這進一步表明使用理論數(shù)據(jù)庫也可以得到很好的蛋白質(zhì)鑒定和定量分析結(jié)果,將給Zeno SWATH DIA數(shù)據(jù)分析帶來很大的便利。
 
圖3. 對比三種不同數(shù)據(jù)庫處理數(shù)據(jù)時的蛋白鑒定結(jié)果

圖3說明:3個不同的數(shù)據(jù)庫(Lib Free,使用在FASTA文件的理論庫;PHL,Pan human公共數(shù)據(jù)庫;ZT Lib,根據(jù)Zeno DDA建立的數(shù)據(jù)庫)。上圖為FDR <1%(柱狀圖透明部分)和CV <20%(柱狀圖實心部分)時蛋白質(zhì)鑒定和定量數(shù)量,下圖為使用非自建數(shù)據(jù)庫方法或自建庫方法中鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量對比,二者重合度很高。
 

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