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生物反應器助力江南大學采用生物法實現PCB藻藍素高水平合成

瀏覽次數:1484 發布日期:2022-7-6  來源:T&J 迪必爾生物
生物反應器應用 | 5L發酵罐實現了PCB藻藍素高水平合成


藻藍素(Phycocyanobilin,PCB)天然存在于藍藻光感應系統中,在光能的吸收和傳遞中起著至關重要的作用,在光遺傳學的研究中被廣泛應用。藻藍素具有亮麗的天藍色,可以作為天然色素,安全健康;也是FDA唯一批準的藍色食品添加劑,營養豐富。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復細胞延緩衰老、保水抗凍的作用,廣泛應用于化妝品領域。此外,作為一種安全的藥物,口服PCB在體內可以轉化為NADPH氧化酶的有效抑制劑,在治療阿爾茨海默癥方面表現出巨大潛力;PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用,有潛力應用于新型冠狀肺炎病毒的防治。

目前,PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題:(1) 甲醇高溫熱解需要耗費大量能量,造成能源浪費;(2) 螺旋藻中與PCB共存的其他色素,如葉綠素、葉黃素等一系列前體,對后期產物純化不利;(3) 螺旋藻生長周期較長,限制了藻藍素的生產效率和應用。因此,從天然藻類中提取高純度的PCB是一項復雜且不經濟的方法。

針對此問題,江南大學未來食品科學中心陳堅院士團隊趙鑫銳副研究員課題組采用生物法合成PCB,降低成本,節約能源,提高純度,在5-L發酵罐實現了PCB高水平合成。ACS Synthetic Biology在線發表了該研究成果“Efficient Synthesis of Phycocyanobilin by Combinatorial Metabolic Engineering in Escherichia coli”。
 

PCB合成途徑

首先,經過比較之后選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA兩種酶來合成PCB。隨即確定含有強誘導啟動子(T7lac)的高拷貝數質粒(pRSFDuet-1)更適合表達這兩種酶。
 

優化HO和PcyA表達策略合成PCB

此外,在中等拷貝數的pCDFDuet-1載體中,采用DNA支架以2:1的比例實現HO和PcyA的有效組裝。
 

通過DNA支架調節HO和PcyA比例提高PCB合成

隨后,通過直接補充血紅素前體ALA和適度過表達血紅素生物合成途徑中的關鍵酶(HemB和HemH),增加細胞內前體物質供應,促進PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應都伴隨著鐵氧還蛋白(Fd)和Fd-NADP+還原酶(Fnr)的循環再生,研究人員通過表達nadK基因(編碼 NAD+激酶)來加速輔因子循環,進一步增強了PCB合成。
 

增強藻藍素合成中輔因子循環

此外,研究人員還通過添加還原劑作為輔助,發現當培養基中加入維生素C或谷胱甘肽時,藻藍素產量會得到提高,進一步優化了維生素C的添加量,發現添加5 g/L維生素C時,適合PCB生產。

分別在搖瓶和發酵罐水平對發酵條件進行優化。在搖瓶水平,在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導,采用含有200 mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H2O和5 g/L維生素C的MR培養基有利于提高PCB的產量。在5-L發酵罐水平(T&J Atype,迪必爾生物工程(上海)有限公司),采用pH-stat法進行補料分批發酵,添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO4·7H2O和200 mg/L FeSO4·7H2O。溫度控制在30°C,pH維持在7.0,通氣量2 L/min,攪拌速率200-800 rpm以保持30%的溶氧水平。
 

5-L發酵罐   T&J Atype  迪必爾生物工程(上海)有限公司


在5-L發酵罐中分批發酵和補料分批發酵進行放大

在發酵罐水平獲得藻藍素28.32 mg/L,打破至今報道的生產記錄。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

參考文獻:
Zhao X, Gao H, Wang Y, Wang Z, Zhou J. Efficient Synthesis of Phycocyanobilin by Combinatorial Metabolic Engineering in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 2022 Jun 17;11(6):2089-2097. doi: 10.1021/acssynbio.2c00016. Epub 2022 May 17. PMID: 35580338.
http://futurefoods.jiangnan.edu.cn/info/1072/1691.htm

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