重組腺相關病毒（recombinant Adeno-associated virus，rAAV）是在腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）的基礎上，通過工程改造得到的一種病毒載體，可在體內或體外中高效地遞送外源基因，在基因治療和科學研究等領域中得到廣泛應用。早在1995年便有研究人員使用rAAV治療囊性纖維化疾病。近年來，多款基于rAAV載體的基因治療藥物獲得美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準，用于治療遺傳性視網膜營養不良和脊髓性肌萎縮癥。同時，在活體成像、神經環路標記、基因敲除、基因敲入和基因編輯等方向，rAAV載體的應用為廣大科研人員實現基因操作等目的提供了便利。

雖然rAAV載體取得了一些成功，但是也面臨較多的問題與挑戰。比如包裝容量較低、某些特定組織或細胞的靶向性不佳、部分血清型的產量較低等，都亟需解決。通過優化rAAV載體的設計和改造衣殼，科研人員逐漸找到解決上述難點的方法。下面給大家介紹rAAV載體的應用痛點和rAAV載體設計與衣殼優化改造的思路。

一、rAAV載體的應用痛點

⭐ 包裝載量低

rAAV一般只能裝載5kb以下的基因片段，超出這個容量，rAAV的出毒量與活性往往大大降低。然而無論用于基因治療的片段或科學研究上的基因長度，有不少被遞送的基因片段大小大于5kb，這大大限制了我們的應用。

⭐ 體內預存免疫，降低rAAV有效性

現有的科學研究已經證明，40%～80%的人有針對rAAV的中和抗體。由于體內預存免疫中和抗體的存在，rAAV侵染靶細胞的效率會受到限制。因此，目的片段的表達將會受到影響。

⭐ 組織靶向性不佳

針對某些細胞或組織，部分rAAV血清型的靶向性較差或沒有合適的血清型。由于rAAV的吸附、入侵、胞內運輸、蛋白酶體降解、入核、脫衣殼等步驟都與衣殼蛋白的結構相關，所以衣殼蛋白的結構是影響rAAV靶向特異性的一個重要因素。

⭐ 轉導能力低、安全性風險高

部分rAAV血清型的轉導能力低，往往需要較高劑量才能實現目的基因的遞送。但會導致治療基因在肝臟富集，產生肝毒性。而rAAV的轉導能力是與衣殼蛋白高度相關。

⭐ 產量低，生產成本高

作為基因治療藥物，要求rAAV的滴度較高。對于系統性用藥，還需要高劑量給藥。但rAAV的產量低，且不同血清型的產量不同。這也是rAAV在基因治療領域中的一個應用難點。已有研究表明，衣殼蛋白對rAAV產量有很大影響。

二、rAAV載體設計和衣殼優化改造

⭐ rAAV載體設計優化

通過優化rAAV載體的設計，能在一定程度上擴大rAAV的裝載容量、提高靶向性和降低免疫原性。對于長度過大的基因片段，可以利用rAAV基因組能通過ITR序列或重疊序列之間的同源重組連接成多聯體的特性，將目的片段拆分成多個小片段，并包裝成兩個或多個rAAV病毒，這樣便可以擴大遞送片段的長度。

特異性啟動子能使目的基因在特定的組織和細胞類型中表達，但一般而言特異性啟動子的活性比CMV等廣譜型病毒啟動子的低。將特異性啟動子與增強子序列結合，可提高特異性啟動子的活性。例如，在hAAT啟動子的基礎上結合了肝臟特異性增強子ApoE，能有效提高目的基因在肝臟的表達水平。此外還可以縮短啟動子的長度，以此擴大目的基因的裝載容量。

還能通過在rAAV基因組的3‘UTR區引入組織特異性表達的miRNA的識別位點，可以有效降低目的基因脫靶的風險和降低免疫原性。比如引入肝臟特異性表達miRNA122a的結合位點，可有效降低肝臟中目的基因的表達。

⭐ rAAV衣殼優化改造

衣殼蛋白對rAAV的轉導能力、靶向性、免疫原性和產量有著重要的影響，因此科研人員希望通過優化改造rAAV的衣殼蛋白，從而改善rAAV的適用性。現今，rAAV衣殼的優化改造有四種策略，分別是天然發現、理性設計、定向進化和計算機輔助的定向進化。

圖1 獲得新型rAAV血清型的主要方法^[6]

現有常用的rAAV血清型大多是天然發現的，但種類較少，難以滿足當今的研究需求。因此，不少研究人員從非人靈長類動物等分離出新型的rAAV血清型。但即使通過天然發現的方法，rAAV的種類仍然較少，并且存在前者的應用問題，因此仍需作進一步的優化改造。

針對常用的rAAV血清型，在分析其衣殼的結構、侵染過程、體內代謝等方面后，可以通過理性設計的策略改造衣殼，提高rAAV轉導率和靶向特異性。常用的方法是在衣殼蛋白的特定位置進行插入和突變修飾。在rAAV衣殼上某些特定的位點插入多肽序列，插入的這些多肽序列不僅不影響rAAV包裝和轉染，還能特異識別特定細胞類型的表面抗原，從而提高rAAV的靶向特異性。例如在rAAV2的第587位點上插入表達靶向人內皮細胞的多肽序列，可有效提高rAAV2對人內皮細胞的靶向能力。此外通過定點突變，改善衣殼蛋白的結構，也能優化rAAV的功能。比如通過對rAAV2的衣殼進行多個位點突變，經過篩選有效突變，發現有多個突變型rAAV2的功能得到優化。主要體現在免疫中和抗體識別與中和突變型rAAV2的能力大大降低。通過理性設計策略可以有效優化rAAV的功能，但這種策略有較大的缺點，比如依賴科研人員的設計經驗、成功概率低和只能發現有限的rAAV衣殼變體等。

定向進化策略可以很好地解決理性設計策略遇到的瓶頸。定向進化無需了解rAAV的作用機制、衣殼結構等背景，只需通過隨機點突變、體外重組等方法構建高豐度的基因突變文庫，再根據實際需求對文庫給予篩選壓力，經過迭代篩選，富集出目標的新型rAAV變體。應用定向進化的策略，已經篩選出較多的rAAV血清型，比如Tervo等得到了可在神經元內沿軸突逆向運輸的突變圖rAAV2-retro。雖然定向進化可以篩選到多種的血清型，但是這種策略技術門檻高、周期長和成本高，在一定程度上限制了血清型的改造。

對于定向進化遇到的瓶頸，“計算機輔助定向進化”是一個良好的思路和解決方案。特別是人工智能輔助rAAV衣殼蛋白設計的方式，具有高通量、成本低和周期短等優點。其大致的過程是通過構建大型的rAAV載體文庫并包裝成病毒，經過體內體外實驗，并獲得數據。將數據用于訓練和優化AI模型。再根據實際需求（高滴度、特異靶向、低免疫原性等），用AI模型預測出合適的新型血清型。再經過體內體外的實驗驗證，判斷新型血清型的有效性。AI預測模型能為衣殼蛋白的定向進化和理性設計提供參考，大大提高rAAV優化改造的成功率。

圖2 基于AI的高效rAAV衣殼蛋白優化流程

來源：DYNO官網

三、總結

rAAV在基因治療和科學研究等領域有著廣泛的應用前景，但面臨諸如靶向性不佳、轉導能力低、體內預存免疫等難題。雖然通過優化載體設計能在一定程度上得到解決，但開發新型血清型卻能從根本上突破這些瓶頸。為了全面、有效、快捷、低成本地開發新型血清型，AI輔助定向進化這一策略提供了良好的思路。相信在不久的將來，越來越多的新型rAAV將會被發現，便于廣大科研人員的研究和造福基因疾病的患者。

四、參考文獻

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