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高光譜受激拉曼散射顯微術(shù)對植物組織進行高光譜化學(xué)成像

瀏覽次數(shù):1491 發(fā)布日期:2022-5-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負
受激拉曼散射(SRS)顯微術(shù)利用基于分子振動特征的化學(xué)特異性,可實現(xiàn)無標記生物成像。超光譜SRS成像可以獲得每個像素的分子振動光譜,不僅能夠研究各種生物分子的光譜差異,還可根據(jù)它們的光譜差異區(qū)分出不同成分。然而由于光譜差異的細微性,以前的無標記SRS成像可辨別的成分的數(shù)量只有4個。日本研究人員Takanori Iino等使用高光譜SRS對植物組織進行了成像,包括山茶(Camellia japonica)葉子、擬南芥(Arabidopsis thaliana)根和苔類植物(Marchantia polymorpha L)的葉狀體。表明SRS可以在沒有標記的情況下區(qū)分苔類植物中多達6種成分。結(jié)果證明超光譜SRS成像可用于無標記多色成像分析植物組織中的各種生物分子。文章以“Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulatedRaman scattering microscopy”為題發(fā)表于ROC Analyst
 
 背景

 觀察各種生物分子的分布對理解生命系統(tǒng)的機制很重要。受激拉曼散射(Stimulated Raman scattering, SRS)顯微技術(shù)可實時獲取分子振動圖像并得到廣泛應(yīng)用,如無標記成像各種細胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開發(fā)出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個像素的分子振動光譜,以區(qū)分出不同化學(xué)成分,實現(xiàn)多色無標記成像。

 但高光譜SRS顯微術(shù)辨別不同分子的能力還有待充分開發(fā)?紤]到典型生物分子的光譜寬度(約10cm-1)與碳-氫(C-H)拉伸區(qū)寬度(約200cm-1)之比,原則上高光譜SRS可以根據(jù)分子振動光譜的差異區(qū)分多達10種以上成分。而事實上在C-H拉伸區(qū)高光譜SRS成像可以區(qū)分的成分數(shù)量通常為3-4個,因為典型的生物分子在C-H拉伸區(qū)往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異,還可利用強度差異在哺乳動物細胞中實現(xiàn)五種成分分類,但這種分類缺乏形態(tài)學(xué)細節(jié)。有報道在指紋區(qū)對植物組織進行拉曼成像應(yīng)用,指紋區(qū)光譜特征比C-H拉伸區(qū)更豐富,最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號的影響,可能會影響分解結(jié)果,因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結(jié)果。

 本研究在C-H拉伸區(qū)使用超光譜SRS顯微技術(shù),證明能夠?qū)ν暾参锝M織進行無標記多色成像。具體而言,對山茶葉(Camellia japonica)進行三色成像,對擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉、初生根頂端和中部進行四色成像,對苔類植物(Marchantia polymorpha L.)葉狀體進行六色成像。預(yù)期在植物組織中生物分子組成研究方面,超光譜SRS顯微術(shù)能夠成為一種有效的無標記成像分析工具。
  圖1 自制SRS顯微鏡示意圖。使用(i)雙色同步皮秒泵浦脈沖和波長可調(diào)的斯托克斯脈沖;(ii)由共振振鏡掃描儀和普通振鏡掃描儀組成的X-Y掃描儀;(iii)物鏡將泵浦和斯托克斯脈沖聚焦到樣品上(下)并收集通過樣品傳輸?shù)拿}沖(上);(iv)提取泵浦脈沖的濾光器,泵浦脈沖由硅檢測器檢測,硅檢測器連接到自制的鎖定放大器以獲取SRS信號。

 結(jié)果

 首先獲得山茶(Camellia japonica)葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數(shù)據(jù)集舉例。從測量的超光譜SRS數(shù)據(jù)中手動提取光譜基(圖2b)。根據(jù)光譜形狀和形態(tài)推測,2940cm-1處顯示峰(CH3拉伸模式)的是細胞壁(黃線)、2850-2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)(烷基鏈)的是飽和脂肪酸(品紅線)、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數(shù)尾部的是水(黑線)。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示,其中品紅色和黃色部位的形態(tài)與角質(zhì)層蠟質(zhì)層和細胞壁的形態(tài)一致。另外這些成分的重疊分布(雙向箭頭所示的黃褐色部位)證實了細胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體的存在,其作用是調(diào)節(jié)分子運輸進出植物體,影響對不同病原體感染的反應(yīng)。
 
  圖2 山茶花一片葉子的SRS成像。(a)葉片橫截面積的SRS圖像數(shù)據(jù)集示意,由91幅光譜圖像組成。為清晰起見對圖像進行了裁剪。(b)用作光譜基的振動光譜。(c)每種成分的圖像。(d)多色圖像。比例尺10 μm。雙向箭頭表示細胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體。
  圖3為擬南芥(Arabidopsis thaliana)的SRS圖像,擬南芥是植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中的典型模式物種。具體來說,對蓮座葉和初生根的中部和頂端進行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中,都能將SRS數(shù)據(jù)集分解成四個組成部分。在蓮座葉(圖3a)中,推測提取的光譜分別是細胞壁(紅線)、由于雙光子吸收而表現(xiàn)出寬光譜響應(yīng)的色素(綠線)、在2850和2880cm-1處表現(xiàn)出尖銳峰的蠟酯(藍線),和水(黑線)。分解組分的空間分布與細胞形態(tài)一致。

 在初生根的中部(圖3b)鑒別出四個光譜,推測為次生細胞壁(紅線)、在2930cm-1處顯示峰值,在2910cm-1處信號比木質(zhì)素小的蛋白質(zhì)(綠線)、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)(烷基鏈)的飽和脂肪酸(藍線)、水(黑線)。同樣,分解成分的空間分布與導(dǎo)管中次生細胞壁、胞質(zhì)溶膠和木栓質(zhì)層的形態(tài)一致,其中木栓質(zhì)層似乎存在于內(nèi)皮層細胞的表面,這意味著可以觀察到凱氏帶(Casparian strip),一種細胞壁材料的帶,類似沉積在內(nèi)皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。

 在初生根的頂端(圖3c),推測光譜是細胞壁(紅線)、蛋白質(zhì)(綠線)、在2910cm-1處有峰的多糖(藍線)、和水(黑線)。分解成分的空間分布與細胞壁、胞質(zhì)溶膠和積累淀粉的淀粉質(zhì)體的形態(tài)一致。由此使用SRS顯微術(shù)可以無標記的方式獲得四色圖像。
 
 圖3 擬南芥葉片和初生根的SRS成像。(a)蓮座葉。(b)初生根的中部。(c)初生根的尖端。(i)、(ii)和(iii)分別為用作光譜基的提取光譜、每種成分的圖像和合并的SRS圖像。(a)-(c)中的(iii)合并圖像顯示了各種結(jié)構(gòu),如(a)中細胞壁(紅色)、葉綠素(綠色)和角質(zhì)層(藍色);(b)中次級細胞壁(紅色)、胞質(zhì)溶膠(綠色)和存在于內(nèi)皮層細胞表面的片層上的木栓質(zhì)層(藍色);(c)中細胞壁(紅色)、胞質(zhì)溶膠(綠色)和淀粉體(藍色)。
 圖4為地錢(Marchantia polymorpha L.)葉狀體的SRS圖像,提取了六個光譜(圖4a)用作光譜基。推測提取的光譜為:范圍2850-2930cm-1寬光譜(烷基鏈),在3010cm-1處具有尖峰(C-C雙鍵相關(guān)的C-H拉伸模式)的不飽和脂肪酸(紅線)、色素(綠線)、油體中包含的次級代謝物(可能是萜類化合物和芳香成分的高度多樣混合物)(藍線),其在2910cm-1(CH2反對稱拉伸模式)和3050cm-1(芳香C-H拉伸模式)顯示出強峰、飽和脂肪酸(品紅線)、細胞壁(黃線)和水(黑線)。圖4b顯示了分解成分的空間分布,與脂滴、葉綠體、油體、角質(zhì)層蠟層和細胞壁的形態(tài)一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像,展示了通過超光譜SRS成像獲得的無標記六色成像圖。
 
  圖4 地錢(Marchantia polymorpha L.)葉狀體的SRS成像。(a)提取光譜用作光譜基。(b)每種成分的圖像。(c)合并的SRS圖像,顯示不同結(jié)構(gòu):脂滴(紅色)、葉綠素(綠色)、油體(藍色)、角質(zhì)層(洋紅色)、細胞壁(黃色)。(d)地錢全株的照片。

 結(jié)論

 本文利用高光譜SRS成像展示了各種類型植物組織的多色無標記成像,實現(xiàn)了通過線性解混方法區(qū)分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細胞壁和液泡等細胞器中積累的色素的自發(fā)熒光通常會妨礙熒光成像,高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的成像分析。

 但該方法一個重要的技術(shù)挑戰(zhàn)是高光譜SRS數(shù)據(jù)集中成分的自動分類。本研究的光譜基是通過研究許多像素的光譜來手動提取的,既費時又費力,而且一旦它們反映的不是純成分,則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨立的,偽矩陣反演會產(chǎn)生噪聲圖像,這可表明組分的數(shù)量。目前還沒有成功量化光譜分析的準確性。雖然已有各種自動提取光譜基或分類不同細胞成分的算法,但使用這些算法提取多達六個成分似乎仍然較為困難,仍需要開發(fā)新的分類方法。

 總之本文證明了超光譜SRS顯微術(shù)可用于植物組織的無標記多色成像,利用其分子識別能力,可對多達六種成分進行無標記多色成像。隨著光譜提取方法的發(fā)展,超光譜SRS顯微術(shù)的能力將得到進一步發(fā)展,成為植物組織無標簽多色成像分析的有力工具。

  參考文獻:Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.
發(fā)布者:北京心聯(lián)光電科技有限公司
聯(lián)系電話:4006828786
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