高光譜受激拉曼散射顯微術(shù)對植物組織進行高光譜化學(xué)成像
受激拉曼散射（SRS）顯微術(shù)利用基于分子振動特征的化學(xué)特異性，可實現(xiàn)無標記生物成像。超光譜SRS成像可以獲得每個像素的分子振動光譜，不僅能夠研究各種生物分子的光譜差異，還可根據(jù)它們的光譜差異區(qū)分出不同成分。然而由于光譜差異的細微性，以前的無標記SRS成像可辨別的成分的數(shù)量只有4個。日本研究人員Takanori Iino等使用高光譜SRS對植物組織進行了成像，包括山茶（Camellia japonica）葉子、擬南芥（Arabidopsis thaliana）根和苔類植物（Marchantia polymorpha L）的葉狀體。表明SRS可以在沒有標記的情況下區(qū)分苔類植物中多達6種成分。結(jié)果證明超光譜SRS成像可用于無標記多色成像分析植物組織中的各種生物分子。文章以“Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulatedRaman scattering microscopy”為題發(fā)表于ROC Analyst。
背景
觀察各種生物分子的分布對理解生命系統(tǒng)的機制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）顯微技術(shù)可實時獲取分子振動圖像并得到廣泛應(yīng)用，如無標記成像各種細胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開發(fā)出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個像素的分子振動光譜，以區(qū)分出不同化學(xué)成分，實現(xiàn)多色無標記成像。
但高光譜SRS顯微術(shù)辨別不同分子的能力還有待充分開發(fā)�？紤]到典型生物分子的光譜寬度（約10cm-1）與碳-氫（C-H）拉伸區(qū)寬度（約200cm-1）之比，原則上高光譜SRS可以根據(jù)分子振動光譜的差異區(qū)分多達10種以上成分。而事實上在C-H拉伸區(qū)高光譜SRS成像可以區(qū)分的成分數(shù)量通常為3-4個，因為典型的生物分子在C-H拉伸區(qū)往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異，還可利用強度差異在哺乳動物細胞中實現(xiàn)五種成分分類，但這種分類缺乏形態(tài)學(xué)細節(jié)。有報道在指紋區(qū)對植物組織進行拉曼成像應(yīng)用，指紋區(qū)光譜特征比C-H拉伸區(qū)更豐富，最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號的影響，可能會影響分解結(jié)果，因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結(jié)果。
本研究在C-H拉伸區(qū)使用超光譜SRS顯微技術(shù)，證明能夠?qū)ν暾参锝M織進行無標記多色成像。具體而言，對山茶葉（Camellia japonica）進行三色成像，對擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉、初生根頂端和中部進行四色成像，對苔類植物（Marchantia polymorpha L.）葉狀體進行六色成像。預(yù)期在植物組織中生物分子組成研究方面，超光譜SRS顯微術(shù)能夠成為一種有效的無標記成像分析工具。
圖1 自制SRS顯微鏡示意圖。使用（i）雙色同步皮秒泵浦脈沖和波長可調(diào)的斯托克斯脈沖；（ii）由共振振鏡掃描儀和普通振鏡掃描儀組成的X-Y掃描儀；（iii）物鏡將泵浦和斯托克斯脈沖聚焦到樣品上（下）并收集通過樣品傳輸?shù)拿}沖（上）；（iv）提取泵浦脈沖的濾光器，泵浦脈沖由硅檢測器檢測，硅檢測器連接到自制的鎖定放大器以獲取SRS信號。
結(jié)果
首先獲得山茶（Camellia japonica）葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數(shù)據(jù)集舉例。從測量的超光譜SRS數(shù)據(jù)中手動提取光譜基（圖2b）。根據(jù)光譜形狀和形態(tài)推測，2940cm-1處顯示峰（CH3拉伸模式）的是細胞壁（黃線）、2850-2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的是飽和脂肪酸（品紅線）、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數(shù)尾部的是水（黑線）。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示，其中品紅色和黃色部位的形態(tài)與角質(zhì)層蠟質(zhì)層和細胞壁的形態(tài)一致。另外這些成分的重疊分布（雙向箭頭所示的黃褐色部位）證實了細胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體的存在，其作用是調(diào)節(jié)分子運輸進出植物體，影響對不同病原體感染的反應(yīng)。
圖2 山茶花一片葉子的SRS成像。（a）葉片橫截面積的SRS圖像數(shù)據(jù)集示意，由91幅光譜圖像組成。為清晰起見對圖像進行了裁剪。（b）用作光譜基的振動光譜。（c）每種成分的圖像。（d）多色圖像。比例尺10 μm。雙向箭頭表示細胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體。
圖3為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS圖像，擬南芥是植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中的典型模式物種。具體來說，對蓮座葉和初生根的中部和頂端進行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中，都能將SRS數(shù)據(jù)集分解成四個組成部分。在蓮座葉（圖3a）中，推測提取的光譜分別是細胞壁（紅線）、由于雙光子吸收而表現(xiàn)出寬光譜響應(yīng)的色素（綠線）、在2850和2880cm-1處表現(xiàn)出尖銳峰的蠟酯（藍線），和水（黑線）。分解組分的空間分布與細胞形態(tài)一致。
在初生根的中部（圖3b）鑒別出四個光譜，推測為次生細胞壁（紅線）、在2930cm-1處顯示峰值，在2910cm-1處信號比木質(zhì)素小的蛋白質(zhì)（綠線）、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的飽和脂肪酸（藍線）、水（黑線）。同樣，分解成分的空間分布與導(dǎo)管中次生細胞壁、胞質(zhì)溶膠和木栓質(zhì)層的形態(tài)一致，其中木栓質(zhì)層似乎存在于內(nèi)皮層細胞的表面，這意味著可以觀察到凱氏帶（Casparian strip），一種細胞壁材料的帶，類似沉積在內(nèi)皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。
在初生根的頂端（圖3c），推測光譜是細胞壁（紅線）、蛋白質(zhì)（綠線）、在2910cm-1處有峰的多糖（藍線）、和水（黑線）。分解成分的空間分布與細胞壁、胞質(zhì)溶膠和積累淀粉的淀粉質(zhì)體的形態(tài)一致。由此使用SRS顯微術(shù)可以無標記的方式獲得四色圖像。 
圖3 擬南芥葉片和初生根的SRS成像。（a）蓮座葉。（b）初生根的中部。（c）初生根的尖端。（i）、（ii）和（iii）分別為用作光譜基的提取光譜、每種成分的圖像和合并的SRS圖像。（a）-（c）中的（iii）合并圖像顯示了各種結(jié)構(gòu)，如（a）中細胞壁（紅色）、葉綠素（綠色）和角質(zhì)層（藍色）；（b）中次級細胞壁（紅色）、胞質(zhì)溶膠（綠色）和存在于內(nèi)皮層細胞表面的片層上的木栓質(zhì)層（藍色）；（c）中細胞壁（紅色）、胞質(zhì)溶膠（綠色）和淀粉體（藍色）。
圖4為地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS圖像，提取了六個光譜（圖4a）用作光譜基。推測提取的光譜為：范圍2850-2930cm-1寬光譜（烷基鏈），在3010cm-1處具有尖峰（C-C雙鍵相關(guān)的C-H拉伸模式）的不飽和脂肪酸（紅線）、色素（綠線）、油體中包含的次級代謝物（可能是萜類化合物和芳香成分的高度多樣混合物）（藍線），其在2910cm-1（CH2反對稱拉伸模式）和3050cm-1（芳香C-H拉伸模式）顯示出強峰、飽和脂肪酸（品紅線）、細胞壁（黃線）和水（黑線）。圖4b顯示了分解成分的空間分布，與脂滴、葉綠體、油體、角質(zhì)層蠟層和細胞壁的形態(tài)一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像，展示了通過超光譜SRS成像獲得的無標記六色成像圖。
圖4 地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS成像。（a）提取光譜用作光譜基。（b）每種成分的圖像。（c）合并的SRS圖像，顯示不同結(jié)構(gòu)：脂滴（紅色）、葉綠素（綠色）、油體（藍色）、角質(zhì)層（洋紅色）、細胞壁（黃色）。（d）地錢全株的照片。
結(jié)論
本文利用高光譜SRS成像展示了各種類型植物組織的多色無標記成像，實現(xiàn)了通過線性解混方法區(qū)分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細胞壁和液泡等細胞器中積累的色素的自發(fā)熒光通常會妨礙熒光成像，高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的成像分析。
但該方法一個重要的技術(shù)挑戰(zhàn)是高光譜SRS數(shù)據(jù)集中成分的自動分類。本研究的光譜基是通過研究許多像素的光譜來手動提取的，既費時又費力，而且一旦它們反映的不是純成分，則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨立的，偽矩陣反演會產(chǎn)生噪聲圖像，這可表明組分的數(shù)量。目前還沒有成功量化光譜分析的準確性。雖然已有各種自動提取光譜基或分類不同細胞成分的算法，但使用這些算法提取多達六個成分似乎仍然較為困難，仍需要開發(fā)新的分類方法。
總之本文證明了超光譜SRS顯微術(shù)可用于植物組織的無標記多色成像，利用其分子識別能力，可對多達六種成分進行無標記多色成像。隨著光譜提取方法的發(fā)展，超光譜SRS顯微術(shù)的能力將得到進一步發(fā)展，成為植物組織無標簽多色成像分析的有力工具。
參考文獻：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.
背景
觀察各種生物分子的分布對理解生命系統(tǒng)的機制很重要。受激拉曼散射（Stimulated Raman scattering, SRS）顯微技術(shù)可實時獲取分子振動圖像并得到廣泛應(yīng)用，如無標記成像各種細胞和組織中的生物分子、代謝成像、超多路成像。近期開發(fā)出的幾種超光譜SRS成像方法可以獲得每個像素的分子振動光譜，以區(qū)分出不同化學(xué)成分，實現(xiàn)多色無標記成像。
但高光譜SRS顯微術(shù)辨別不同分子的能力還有待充分開發(fā)�？紤]到典型生物分子的光譜寬度（約10cm-1）與碳-氫（C-H）拉伸區(qū)寬度（約200cm-1）之比，原則上高光譜SRS可以根據(jù)分子振動光譜的差異區(qū)分多達10種以上成分。而事實上在C-H拉伸區(qū)高光譜SRS成像可以區(qū)分的成分數(shù)量通常為3-4個，因為典型的生物分子在C-H拉伸區(qū)往往具有相似的光譜。高光譜SRS圖像的光譜相量分析不僅可以利用光譜特征差異，還可利用強度差異在哺乳動物細胞中實現(xiàn)五種成分分類，但這種分類缺乏形態(tài)學(xué)細節(jié)。有報道在指紋區(qū)對植物組織進行拉曼成像應(yīng)用，指紋區(qū)光譜特征比C-H拉伸區(qū)更豐富，最終多元分解出6種成分。然而拉曼成像受到各種背景信號的影響，可能會影響分解結(jié)果，因此不同的分解算法間似乎仍然難以獲得一致的結(jié)果。
本研究在C-H拉伸區(qū)使用超光譜SRS顯微技術(shù)，證明能夠?qū)ν暾参锝M織進行無標記多色成像。具體而言，對山茶葉（Camellia japonica）進行三色成像，對擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉、初生根頂端和中部進行四色成像，對苔類植物（Marchantia polymorpha L.）葉狀體進行六色成像。預(yù)期在植物組織中生物分子組成研究方面，超光譜SRS顯微術(shù)能夠成為一種有效的無標記成像分析工具。
結(jié)果
首先獲得山茶（Camellia japonica）葉子的SRS成像。圖2a為葉子的數(shù)據(jù)集舉例。從測量的超光譜SRS數(shù)據(jù)中手動提取光譜基（圖2b）。根據(jù)光譜形狀和形態(tài)推測，2940cm-1處顯示峰（CH3拉伸模式）的是細胞壁（黃線）、2850-2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的是飽和脂肪酸（品紅線）、源于約3200cm-1處羥基拉伸模式的低波數(shù)尾部的是水（黑線）。各成分的圖像如圖2c所示。合成的多色圖像如圖2d所示，其中品紅色和黃色部位的形態(tài)與角質(zhì)層蠟質(zhì)層和細胞壁的形態(tài)一致。另外這些成分的重疊分布（雙向箭頭所示的黃褐色部位）證實了細胞壁-角質(zhì)層連續(xù)體的存在，其作用是調(diào)節(jié)分子運輸進出植物體，影響對不同病原體感染的反應(yīng)。
圖3為擬南芥（Arabidopsis thaliana）的SRS圖像，擬南芥是植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究中的典型模式物種。具體來說，對蓮座葉和初生根的中部和頂端進行了高光譜SRS成像。所有擬南芥樣本中，都能將SRS數(shù)據(jù)集分解成四個組成部分。在蓮座葉（圖3a）中，推測提取的光譜分別是細胞壁（紅線）、由于雙光子吸收而表現(xiàn)出寬光譜響應(yīng)的色素（綠線）、在2850和2880cm-1處表現(xiàn)出尖銳峰的蠟酯（藍線），和水（黑線）。分解組分的空間分布與細胞形態(tài)一致。
在初生根的中部（圖3b）鑒別出四個光譜，推測為次生細胞壁（紅線）、在2930cm-1處顯示峰值，在2910cm-1處信號比木質(zhì)素小的蛋白質(zhì)（綠線）、在2850至2930cm-1處顯示平坦響應(yīng)（烷基鏈）的飽和脂肪酸（藍線）、水（黑線）。同樣，分解成分的空間分布與導(dǎo)管中次生細胞壁、胞質(zhì)溶膠和木栓質(zhì)層的形態(tài)一致，其中木栓質(zhì)層似乎存在于內(nèi)皮層細胞的表面，這意味著可以觀察到凱氏帶（Casparian strip），一種細胞壁材料的帶，類似沉積在內(nèi)皮層徑向和橫向壁中的栓蛋白。
在初生根的頂端（圖3c），推測光譜是細胞壁（紅線）、蛋白質(zhì)（綠線）、在2910cm-1處有峰的多糖（藍線）、和水（黑線）。分解成分的空間分布與細胞壁、胞質(zhì)溶膠和積累淀粉的淀粉質(zhì)體的形態(tài)一致。由此使用SRS顯微術(shù)可以無標記的方式獲得四色圖像。
圖4為地錢（Marchantia polymorpha L.）葉狀體的SRS圖像，提取了六個光譜（圖4a）用作光譜基。推測提取的光譜為：范圍2850-2930cm-1寬光譜（烷基鏈），在3010cm-1處具有尖峰（C-C雙鍵相關(guān)的C-H拉伸模式）的不飽和脂肪酸（紅線）、色素（綠線）、油體中包含的次級代謝物（可能是萜類化合物和芳香成分的高度多樣混合物）（藍線），其在2910cm-1（CH2反對稱拉伸模式）和3050cm-1（芳香C-H拉伸模式）顯示出強峰、飽和脂肪酸（品紅線）、細胞壁（黃線）和水（黑線）。圖4b顯示了分解成分的空間分布，與脂滴、葉綠體、油體、角質(zhì)層蠟層和細胞壁的形態(tài)一致。圖4c為葉狀體的合并SRS圖像，展示了通過超光譜SRS成像獲得的無標記六色成像圖。
結(jié)論
本文利用高光譜SRS成像展示了各種類型植物組織的多色無標記成像，實現(xiàn)了通過線性解混方法區(qū)分微小的光譜差異。鑒于葉綠體、細胞壁和液泡等細胞器中積累的色素的自發(fā)熒光通常會妨礙熒光成像，高光譜SRS成像將特別適用于植物組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的成像分析。
但該方法一個重要的技術(shù)挑戰(zhàn)是高光譜SRS數(shù)據(jù)集中成分的自動分類。本研究的光譜基是通過研究許多像素的光譜來手動提取的，既費時又費力，而且一旦它們反映的不是純成分，則偽矩陣反演給出的圖像也是成分的混合體。此外如果一些譜基不是線性獨立的，偽矩陣反演會產(chǎn)生噪聲圖像，這可表明組分的數(shù)量。目前還沒有成功量化光譜分析的準確性。雖然已有各種自動提取光譜基或分類不同細胞成分的算法，但使用這些算法提取多達六個成分似乎仍然較為困難，仍需要開發(fā)新的分類方法。
總之本文證明了超光譜SRS顯微術(shù)可用于植物組織的無標記多色成像，利用其分子識別能力，可對多達六種成分進行無標記多色成像。隨著光譜提取方法的發(fā)展，超光譜SRS顯微術(shù)的能力將得到進一步發(fā)展，成為植物組織無標簽多色成像分析的有力工具。
參考文獻：Iino, T. , et al. "Multicolour chemical imaging of plant tissues with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy." Analyst.
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