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鼠源脂肪間充質干細胞的分離培養實驗經驗分享

瀏覽次數:941 發布日期:2022-5-5  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
脂肪間充質干細胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是來源于脂肪組織的干細胞,與其它成體干細胞一樣具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪組織均可用于分離ADSCs,其中鼠脂肪組織通常取自腹股溝處脂肪墊。聽說你們都想偷師ADSCs原代取材,那就來安排!

⭐ 材料準備
✔ OriCell®大鼠脂肪間充質干細胞完全培養基(貨號:RAXMD-90011)
✔ OriCell®胰蛋白酶細胞消化液(0.25%)(貨號:TEDTA-10001)
✔ 0.1% I型膠原酶溶液

⭐ 實驗步驟
1、10天齡到4周齡大鼠1只,麻醉處死,75%乙醇浸泡消毒3~5min。無菌條件下切開腹股溝皮膚,暴露腹股溝脂肪墊。
2、鈍性剝離脂肪組織,清洗并去除筋膜組織及小血管。將脂肪墊剪碎,轉移至15mL離心管中。
3、加入3~4倍體積的0.1% I型膠原酶溶液,37℃水浴振蕩約20min,直至細胞混合物成乳狀濃稠液體。期間可吹打脂肪組織,輔助消化。
4、250×g,4℃,離心5min。注意離心機預冷至4℃。
5、小心吸去上層油脂,注意不要破壞位于下方的膠狀沉淀。加人5mL完全培養基,重懸沉淀,轉移到新的離心管中,再次離心5min。
6、重復洗滌一次,吸去上清。
7、加入8mL完全培養基重懸沉淀,轉移至T25培養瓶中,置于37℃,5% CO2溫箱中。
8、待細胞貼壁生長48h后首次觀察、換液。
9、換液時通過棄去培養基,從而去除未貼壁的細胞。
10、以后每兩天更換一次培養基,細胞匯合達80%-90%時,0.25%胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例首次傳代。

⭐ 注意事項
✔ 取材時應將組織清洗干凈,仔細剝離去除血管和筋膜組織
✔ 脂肪組織在剪碎的過程中不能研磨,以免破壞細胞
✔ 消化完后的組織在離心前把離心機預冷,使細胞更好的與油脂分離
✔ 用明膠或者膠原蛋白處理培養皿底壁,有利于細胞的貼壁生長

⭐ 鑒定
1、形態學觀察:原代培養后,傳代2-3次,ADSCs呈現單層,梭狀或多枝狀的細胞形態,其直徑在25-30 um,待細胞達到匯合時,它們形態上呈紡錘形,類似于成纖維細胞,貼壁較牢固。

 

 
2、微生物:常使用培養法和PCR法檢測細菌、真菌、支原體。
3、增殖:CCK8生長曲線,計算倍增時間。
4、標記物檢測:一般的標準為CD29、CD44、CD73、CD105為陽性(>70%);CD34、CD45、CD11b為陰性(<5%)。
5、誘導分化實驗:在特定的誘導條件下,脂肪間充質干細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、上皮細胞、心肌細胞等多種細胞。
發布者:賽業(蘇州)生物科技有限公司
聯系電話:400-680-8038
E-mail:info@cyagen.com

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