Genizer脂質體擠出儀在類細胞微囊泡（mCVTs）制備中的應用
關鍵詞：類細胞微囊泡、基因遞送、細胞轉染、難轉染細胞的新型基因遞送技術。
新加坡國立大學研究團隊在本研究中，介紹了一種新型的基于微細胞囊泡技術 ( micro Cell Vesicle Technology mCVT)的嵌合型基因遞送平臺系統。這種基因遞送平臺系統由細胞膜和陽離子脂質融合而成，被用于提高難轉染（hard-to-transfect HTT）細胞的轉染效率。微細胞囊泡的細胞膜成分賦予整個復合體胞吞特異性，減少了轉染過程中的復合體細胞毒性，而陽離子脂質負責與遺傳物質相結合，同時為mCVTs提供了結構完整性。
圖1 利用類細胞微囊泡技術進行難轉染細胞的轉染過程示意
背景
基因遞送是將外來DNA引入真核細胞的過程。如在基礎研究（如藥物發現和功能蛋白的機理研究）和臨床應用（如基因治療）中傳遞治療性或功能性基因以改變細胞過程。有效的基因轉染不僅需要成功地將外來核酸引入細胞，而且還需要它們隨后在細胞中的轉運和表達。這是一項具有挑戰性的任務，因為DNA分子本身是帶負電荷，因此在其常規形式下很難被細胞內化。因此，人們對開發有效的基因傳遞系統產生了極大的興趣。在過去的幾十年里，人們探索了大量的載體系統，從基于病毒的遞送系統到非病毒載體。盡管非病毒基因遞送載體的轉染效率相對較低，但在安全性和臨床接受度方面有望成為首選，其中陽離子脂質系統和基于聚合物的平臺是主要的例子。表1總結了目前常用的轉染試劑或方法的主要優缺點。
表1 目前主要轉染試劑/方法的優缺點
理想的非病毒基因遞送系統應能有效地將所需的DNA分子遞送到特定的細胞類型中，且細胞毒性最小，以確保目標基因的最大表達。然而，據我們所知，目前市售的轉染試劑明顯達不到這些標準，特別是當它們被用于轉染難轉染（HTT）細胞時。
表2 常用轉染試劑與方法對HTT細胞的轉染效率
HTT細胞通常包括原代細胞、胚胎干細胞和一些永生化細胞系，如3T3-L1（小鼠前脂肪細胞）、U937（人單核細胞）、Jurkat（人T淋巴細胞）、HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）等。據統計使用市售試劑對HTT細胞進行質粒轉染的效率經常不超過25%。HTT細胞對外來物質和質粒的吸收率低的原因之一是其代謝活性低。此外，這些細胞通常對所使用的轉染試劑引起的細胞擾動非常敏感，有可能導致細胞毒性，最終導致細胞死亡。
最近，鑒于細胞來源的遞送系統有可能在一定程度上特異性地將活性貨物分子遞送到目標部位，因此獲得了相當的關注。事實上，許多研究已經探索了使用單核細胞衍生的藥物遞送系統（DDS）來定向遞送化療藥物和質粒DNA（pDNA）到腫瘤，或者使用紅細胞衍生的DDS來延長血液循環和定向遞送pDNA到血細胞中。據推測，保留母體細胞的細胞膜成分將賦予這些基于細胞的藥物遞送系統識別特定目標細胞的能力，可能通過逃避身體免疫系統的識別能力來促進。
盡管有重大的治療意義，但迄今為止，基于細胞的DDS在基因傳遞方面的全部潛力在很大程度上仍未得到開發。需要解決的關鍵挑戰包括細胞來源的DDS（如外泌體形式）的繁瑣和低通量分離/生產過程以及次優的基因裝載/復合技術。因此，雖然這些系統在內在的靶向性方面似乎很有優勢，但它們在產量和pDNA裝載效率方面有很大的局限。因此，為了克服這些限制，我們在此提出開發一種新型的嵌合基因遞送系統，該系統由細胞膜成分和陽離子脂質成分組成，前者用于增強靶細胞的內化，后者用于增強pDNA的裝載。
在這項研究中，我們首次描述了微細胞囊泡技術（mCVTs）的發展，這是一種通過陽離子脂質與細胞膜融合而獲得的新型混合遞送平臺。為了生產mCVTs，首先用低滲水溶液處理細胞來獲得鬼影細胞（CG無細胞質于細胞器細胞），如Goh等人所描述的。低滲溶液在質膜上形成短暫的開口，允許清除細胞內的內容物，同時保持質膜的完整性。來自不同細胞懸浮在水介質中的CG被用來水化干燥的DOTAP脂質薄膜，隨后通過脂質體擠出儀擠出，提供與擠出的DOTAP脂質體相似的平均流體力學尺寸和Zeta電位的mCVTs。在這項研究中，我們證明了mCVTs能夠與質粒復合并被目標細胞內化，而且細胞毒性最小。有趣的是，當從不同細胞類型產生的mCVTs在體外進行比較時，對于mCVTs所來源的細胞類型，它們顯示出明顯更高的轉染效率。
圖2 mCVTs及其結構組件的示意圖
方法與結果
制備鬼影細胞（CG無細胞質與細胞器細胞膜）以確保mCVTs的可重復性和安全狀況。方法與結果 略
mCVTs的生產和特征分析。
與脂質體生產類似，脂質薄膜法被用來生產mCVTs。DOTAP薄膜與CG水合，形成包裹CG的大型多分子脂質體。這種懸浮液被擠出，來自CG的漿膜含有DOTAP脂質（如圖3A所示）。按照我們小組以前建立的方法，證明在擠壓后，這樣產生的mCVTs由脂質和CG膜的融合組成。一般來說，mCVT的大小分布與脂質體相似。為了證明這種方法在各種細胞系中的穩健性和通用性，使用來自不同細胞系的CG制作了mCVTs，如一些HTT細胞（即3T3-L1）和非癌細胞（即HEK293和RAW264.7）。如圖3B所示，各種mCVTs的流體力學尺寸和PDI通常在400納米的范圍內（PDI∼0.4），與使用相同擠壓方法生產的DOTAP脂質體（PDI∼0.2）類似。在圖3C中，不同的配方觀察到類似的zeta電位值（約+30 mV至+40 mV），表明這種方法普遍適用于從不同細胞系產生的CG。有趣的是，當mCVT3T3-L1與pDNA復配時，其大小分布與未復配的mCVTs相似，而整體zeta電位變為負值，這可能表明復配成功（因為帶負電的pDNA使帶正電的mCVTs中和）。
圖3 mCVTs的生產和表征
A. mCVTs的示意圖，涉及細胞鬼魂和水合薄膜制成的脂質體的融合。B. 不同的mCVTs和帶有質粒的mCVT3T3-L1的水動力尺寸與DOTAP脂質體相比。所有mCVTs的尺寸都小于500納米。C. 與DOTAP脂質體相比，不同的mCVTs和帶質粒的mCVT3T3-L1的Zeta電位。所有mCVTs的Zeta電位都在+30 mV以上，除了帶有質粒DNA（5 µg）的mCVT3T3-L1，由于與質粒DNA的相互作用而顯示出負的Zeta電位。數據代表平均值 ± SD（n = 3）。
圖 原文中mCVTs制備與所用脂質體擠出器描述
