稻瘟病是由真菌 Magnaporthe oryzae 感染引起,嚴重威脅水稻產量,甚至可能導致絕產。如何讓作物獲得廣譜抗病性,是植物與病原菌間的“軍備競賽”。在植物與病原菌互作中,植物建立了兩層免疫防衛體系,即病原相關分子模式激發的基礎免疫反應(PTI)和效應蛋白激發的特異性免疫反應(ETI),兩者能夠協調并共同作用促進防御代謝物產生并對抗病原體,然而它們具體如何協調,并激發廣譜抗性仍有待探究。
2021年12月16日,國際Top期刊Nature(IF 49.962)在線發表了中國科學院分子植物科學卓越創新中心何祖華等研究組,題為 “NLRs guard metabolism to coordinate pattern- and effector-triggered immunity” 的論文,揭示了一條全新廣譜免疫代謝調控通路:PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯通路,并證明水稻廣譜抗病蛋白NLR受體調控該代謝通路保護植物,協同整合PTI和ETI,賦予水稻廣譜抗病性的新策略,為農作物抗病育種設計奠定理論基礎。其中,中科新生命提供了TMT蛋白質組、泛素化蛋白鑒定服務。
研究材料
水稻(目標基因敲除或過表達的轉基因水稻)
技術路線
· 步驟1:蛋白質組及蛋白互作分析篩選廣譜抗性NLR蛋白的關鍵作用因子;
· 步驟2:PICI1在ETI和PTI中發揮功能;
· 步驟3:PICI1通過去泛素化作用穩定OsMETS;
· 步驟4:OsMETS穩定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性;
· 步驟5:PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解,PICI1的自然變異有助于亞種免疫分化。
研究結果
1. 蛋白質組及蛋白互作分析篩選廣譜抗性NLR蛋白的關鍵作用因子
以往研究發現,水稻NLR受體蛋白PigmR具有廣譜抗稻瘟病能力,表明其可能整合了PTI和ETI兩種途徑以保證其廣譜抗性。為識別關鍵調控因子,首先通過TMT定量蛋白質組,篩選Chitin誘導植物免疫后的關鍵差異蛋白(與PTI相關);隨后通過酵母雙雜(Y2H),篩選與PigmR受體相互作用的蛋白。結合兩者篩選結果,獲得交集的候選蛋白稱為PICIs (PigmR互作及chitin誘導蛋白),并進行后續深入研究。
圖1 關鍵免疫調控因子PICIs的篩選
2. PICI1在ETI和PTI中發揮功能
進一步,通過免疫共沉淀及共定位等實驗,確認了PICI1與PigmR相互作用。隨后,在野生型近等基因Pigm株系(nili -Pigm)中構建PICI1基因敲除株系、PICI1基因過表達株系(PICI1- OE),發現較野生型和過表達株系相比,敲除株系(PICI1- KO)的抗病性顯著降低。接下來,進一步分析PICI1在PTI中的作用,發現Chitin可誘導PICI1表達,且在PICI1敲除株系(PICI1-KO)中,Chitin誘導的活性氧產生和病原體相關疾病表達被抑制,而在PICI1過表達株系中(PICI1-OE)得以增強。綜上表明,PICI1與PigmR相互作用,并介導ETI和PTI反應。
圖2 PICI1通過與PigmR相互作用,參與PigmR介導抗病性與PTI反應
3. PICI1通過去泛素化作用穩定OsMETS
隨后蛋白序列結構域分析及實驗確認,表明PICI1是一種去泛素化酶。為鑒定其底物,進行了PICI1的免疫共沉淀及質譜分析(IP-MS)將得到的互作蛋白與Chitin誘導的泛素化變化蛋白相交,篩選到20個泛素化候選蛋白,其中包括一個在單子葉和雙子葉中高度保守的蛋氨酸(Met)合酶(LOC_Os12g42876)。結合體外及體內等一系列實驗,發現PICI1存在時OsMETS1-Flag穩定積累,綜上說明OsMETS1是PICI1的底物,PICI1通過去泛素化作用穩定OsMETS。
圖3 PICI1是去泛素化酶,通過去泛素化作用穩定OsMETS
4. OsMETS穩定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性
隨后探究了OsMETS的抗病功能,確認了Chitin或flg22處理引發OsMETS表達積累,蛋氨酸(Met)介導免疫作用可通過誘導病原體相關基因觀察到劑量依賴的Met介導的抗瘟性。綜上表明,OsMETs介導的的生物合成,并在抗稻瘟病中發揮了重要作用。由于Met是乙烯在植物免疫中的前體,用Met處理能增加乙烯的產量,故進一步分析OsMETs是否通過提高乙烯合成發揮作用。實驗表明,采用ACC(乙烯前驅體)預處理增加了抗瘟性,而AVG(乙烯生物合成抑制劑) 預處理降低了抗瘟性。總之,OsMETS穩定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性。
圖4 OsMETS穩定積累增強了蛋氨酸-乙烯生物合成并提高抗瘟性
5. PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解,PICI1的自然變異有助于亞種免疫分化
由于水稻在與病原菌長期處于類似于“軍備競賽”的協同進化中,通過PICI1互作分析找到了病原菌分泌的毒性蛋白(AvrPi9),其能通過降解PICI1,抑制水稻的基礎抗病性(PTI),以有利于病原菌的入侵。然而,水稻進化產生的廣譜抗病NLR受體可以通過抑制病原菌毒性蛋白與PICI1的互作,保護并加強PICI1的功能,進而激活更多的防衛化學物質(蛋氨酸—乙烯)的合成,以獲得廣譜抗病性。
最后,對3000份水稻品種的基因組數據分析發現,PICI1啟動子具有秈粳分化的自然變異位點,與水稻對稻瘟病的田間抗性緊密關聯,從而為水稻抗病育種提供了新的靶點。
圖5 PigmR保護PICI1不被AvrPi9降解,PICI1自然變異有助于亞種免疫
小編小結
本研究綜合利用蛋白質組學、植物病理、分子遺傳等策略,鑒定到一條新的植物免疫代謝通路:PICI1—OsMETS—蛋氨酸—乙烯。證明去泛素化酶PICI1作為一個新的免疫調控蛋白,通過增強蛋氨酸合酶OsMETS的穩定性,促進蛋氨酸介導乙烯代謝通路,參與水稻對抗病原菌的過程中,并且證明該途徑是植物協同整合PTI和ETI兩層免疫系統的重要策略之一,為水稻抗病育種提供新策略。
值得一提的是,文中幾處關鍵因子的篩選利用了基于質譜組學結果,如蛋白質組學、泛素化等,說明組學技術是篩選關鍵調控蛋白的重要方法之一。中科新生命能夠提供蛋白質組、修飾蛋白質組等多種組學檢測服務,歡迎感興趣的老師前來咨詢。
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