肝細胞維持培養(yǎng)基（HMM）試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用     
【適用范圍】
本試劑盒用于維持人原代肝細胞培養(yǎng)，可維持原代肝細胞（PHH）的形態(tài)和功能長達2個月。
【實驗原理】
本試劑盒采用體外培養(yǎng)方法維持人原代肝細胞的形態(tài)和功能，由基礎培養(yǎng)基和營養(yǎng)添加物等成分組成，含有特定生長因子和小分子，可有效抑制人原代肝細胞的衰老、凋亡和去分化，長期維持肝細胞的多角形及雙核形態(tài)和結構，保持白蛋白和細胞色素氧化酶CYP家族等功能蛋白的表達水平和功能狀態(tài)。在肝細胞維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)人原代肝細胞的接種密度為2×10⁴-3×10⁴/cm²，可用于體外肝細胞毒性測試、HBV病毒感染以及肝病發(fā)生過程模擬等研究。
【試劑盒的組成】

試劑盒組成	規(guī)格	6孔板/月用量	保存條件	有效期
說明書	1份	/	/	/
基礎培養(yǎng)基（HepX medium）	500ml	110 ml	2-8℃	1年
營養(yǎng)添加物（HepSup）	40.8ml	10 ml	-20℃	1年
包被液（HepCoat）	200μl	50 μl	-20℃	1年

【肝細胞維持培養(yǎng)基（HMM）配制】
120ml肝細胞維持培養(yǎng)基配制：110 ml HepX medium與10 ml HepSup混勻。
【包被液處理】
使用時將6孔板及槍頭4℃預冷，將HepCoat從-20℃冰箱中取出，在4℃解凍，在冰上快速以1:80的比例與HepX medium混勻，然后包被六孔板，每孔包被0.8 ml，放置37℃，30分鐘后取出后吸走多余混合液。
【使用方法】

• 生物安全柜中，將10ml肝細胞維持培養(yǎng)基加入到15ml離心管中，37℃恒溫水浴鍋預熱10分鐘。
• 將凍存原代肝細胞從液氮中迅速轉移至37℃恒溫水浴鍋中，在水中順時針旋轉解凍約90-120秒，直至凍存管中只有小塊碎冰漂浮。
• 利用鈍槍頭將細胞吸出，并以滴加方式轉移至10ml預熱的肝細胞維持培養(yǎng)基中，輕微上下顛倒2-3次混勻。
• 室溫放置30-45分鐘后（每15分鐘輕輕顛倒混勻一次），再進行低速離心（50×g，常溫離心5分鐘），去上清，用5ml肝細胞維持培養(yǎng)基（HMM）重懸細胞，用臺盼藍染色法測定肝細胞的存活率和細胞總數(shù)。
• 按活細胞數(shù)2×10⁴-3×10⁴/cm²（優(yōu)選3×10⁴/cm²）的密度接種到經包被的培養(yǎng)板中搖勻，在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8小時后，觀察細胞的貼壁狀態(tài)，換液；之后每2天換液一次。

【結果檢測】

• 原代肝細胞形態(tài)學

用肝細胞維持培養(yǎng)基（HMM）進行原代肝細胞的培養(yǎng)，分別在細胞培養(yǎng)的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

• 原代肝細胞功能

分別于細胞培養(yǎng)的第0，3，7，14，21，24，28，35，42，49，56天留取培養(yǎng)細胞的上清，分別用ELISA方法檢測細胞ALB，AAT分泌水平，尿素檢測試劑盒檢測細胞尿素合成能力以及氨清除試劑盒檢測肝細胞解毒能力。
【結果判定】

• 通過形態(tài)學觀察，經過56天培養(yǎng)，肝細胞能維持多角形形態(tài)，基本與原代肝細胞形態(tài)一致。
• 通過ELISA方法檢測，肝細胞擴增培養(yǎng)基可以在56天內有效維持肝細胞對ALB和AAT的分泌能力，同時，尿素合成和氨清除能力與原代肝細胞維持在同一水平。

【注意事項】
          實驗操作應嚴格按照說明書進行。         
          肝細胞維持培養(yǎng)基2~8℃避光保存。