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在球體灌注載玻片養成L929球體進行動態培養實驗的操作

瀏覽次數:1567 發布日期:2021-9-28  來源:ibidi

本應用實驗是在µ-Slide球體灌注載玻片中創建多細胞球體示例。從鼠成纖維細胞系L929的懸浮液形成球狀體后,用ibidi Pump System灌注。這樣可以確保長期培養過程中球體的最佳營養。
 

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材料:

· μ-Slide球體灌注生物惰性載玻片(80350,ibidi,德國)

· 鼠成纖維細胞L929系(ACC 2,DSMZ,德國)

· 細胞培養基(RPMI-1640(21875034)與FCS(10270106),Gibco)

· 切割酶(A1110501,Gibco)

· ibidi泵系統(10902,ibidi,德國)

· 藍色灌注套件,15厘米,內徑0.8毫米(10961,ibidi,德國)

· 標準細胞培養設備(無菌工作臺,細胞培養培養箱,培養瓶,PBS等)

 

重要說明:在37°C和5%CO2的培養箱內過夜,平衡所有必需的材料,如µ-Slides,培養基和管道(灌注套件)。這對于防止氣泡隨時間流逝至關重要。

 

1. 細胞制備和接種

· 在培養基中培養L929細胞。

· 用Accutase處理細胞1-2分鐘以使其脫離。

· 收獲細胞懸液。

· 離心細胞懸液并在培養基中稀釋;該量取決于所需的細胞濃度。

· 計數細胞并調整至5 x 105細胞/ ml的濃度。

· 根據說明準備µ-Slide。

· 將細胞接種到µ-Slide的通道中。不要忘記為靜態控制接種細胞。

· 在37°C和5%CO2下孵育過夜以形成球狀體。

 

2. 球狀體形成

 

· 在相襯顯微鏡下觀察球狀體的形成。

· 可選:形成球狀體后,用新鮮培養基洗滌1次。

在開始灌注之前,在37°C和5%CO2中孵育一小時



3. 灌注實驗

 

· 根據說明準備用于流動連接的µ-Slide,ibidi泵系統和灌注套件。

· 要清除系統中的氣泡,請在連接µ-Slide之前使其運行1-2小時。

· 將µ-Slide連接到管路和泵系統。

· 以5 mbar開始灌注實驗,流速為0.75 ml / min。

· 確定流速。如有必要,請調節壓力以創建所需的流速。

· 對于靜態培養,請按照µ-Slide球體灌注的說明每兩天進行一次培養基更換。

 

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4. 結果

接種后立即開始形成球體。在長期培養過程中,施加流量會導致球體更強的增殖,由于最佳營養,導致球體直徑增加。

 

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L929成纖維細胞在µ-Slide球狀體灌流中顯示球狀體形成,Bioinert,第1-14天,接種濃度為5 x 105單細胞/ ml。上部圖:用ibidi Pump System灌注,0.75毫升/分鐘。下部圖:無灌注,第二天換培養基。相襯顯微鏡,10倍物鏡,孔直徑800 µm。
 

在μ-Slide球狀體灌流,生物惰性,接種濃度5 x 105單細胞/ ml中比較L929成纖維細胞的球狀體形成。靜態:無灌注,第二天換培養基。灌注:使用ibidi Pump System灌注,0.75毫升/分鐘。

 

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