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細胞增殖實驗MTT法操作步驟

瀏覽次數:2145 發布日期:2021-8-30  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
MTT法又稱MTT比色法,是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。
       
一、實驗方法原理
MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑藍為基礎。MTT 為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料,可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環開裂,生成藍色的 formazan 結晶,formazan 結晶的生成量僅與活細胞數目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將 MTT 還原)。還原生成的 formazan 結晶可在含 50% 的 N,N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解,利用酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值,以反映出活細胞數目。也可以用 DMSO 來溶解。
 
二、實驗材料
1.細胞樣品
2.試劑、試劑盒:10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO
3.儀器、耗材:96 孔板 離心機 酶聯免疫監測儀
 
三、實驗步驟        
1.接種細胞
用含 10% 胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔 1000-10000 個細胞接種到 96 孔板,每孔體積 200ul。
2.培養細胞
同一般培養條件,培養 3-5 天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。
3.呈色
培養 3-5 天后,每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 配)20ul. 繼續孵育 4 小時,終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO,振蕩 10 分鐘,使結晶物充分融解。
4.比色
選擇 490nm 波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
 
發布者:上海博湖生物科技有限公司銷售部
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