近期，由北京大學第三醫院運動醫學科領導的研究團隊在《Acta Biomaterialia》雜志上發表題為“Comparison of three different acidic solutions in tendon decellularized extracellular matrix bio-ink fabrication for 3D cell printing ”的論文，比較了三種酸性溶液0.5M醋酸（AA）、0.1M鹽酸（HA）和0.02M鹽酸（HA）在肌腱衍生的脫細胞胞外基質（Decellularized extracellular matrix ，dECM）生物墨水用于3D細胞打印的生物制備中的應用，研究表明0.1M HA能加快dECM粉末的消化速度，使得其制作的dECM水凝膠的剛度降低，變得更柔軟，可促進包被細胞的擴散和增殖，表現出更好的肌腱誘導能力。
 

dECM水凝膠由于具有良好的細胞相容性和仿生特性，在3D細胞打印生物墨水中的應用日益受到重視。生物墨水的滲透壓和剛度是影響打印細胞生物學功能的重要因素，然而對dECM在這方面的關注卻很少，這項研究首先比較了三種常用酸性溶液在肌腱dECM水凝膠制備中的消化狀況，然后比較了三種肌腱衍生的dECM水凝膠的滲透壓和流變特性，再將干細胞與三種肌腱來源的dECM水凝膠結合，用于3D生物打印。
 

圖1. 研究設計示意圖

3D細胞打印

首先，研究人員制備豬肌腱脫細胞及dECM粉末，之后通過添加3mg/mL胃蛋白酶在0.5M AA，0.1M HA或0.02M HA溶液中酶解制備dECM生物墨水。同時提取鼠骨髓間充質干細胞，并做成骨、成脂、成軟骨細胞三系分化鑒定。再將第三代BMSCs的細胞懸液與中和的dECM生物墨水混合，給0.5M AA、0.1M HA和0.02M HA制的生物墨水設定印刷壓力，生物打印速度均設定為15毫米/秒。在直徑6cm的細胞培養皿上打印層距100μm、20×20mm的三層網格結構。打印的細胞負載結構在37°C和5%的二氧化碳中孵育，并分別于第3、6、9、13天更換培養皿培養液（圖2）。本實驗中使用的BMSCs三系分化培養基和染色液均購自賽業OriCell®。
 

圖2. 在不同印刷頭速度下，每個組的形狀保真度值

三種生物墨水打印效果比較

研究人員評估了加入培養基前細胞被水凝膠包裹的時間對三種dECM水凝膠細胞活力的影響。0.5M AA組在加入細胞培養基前，隨著包封時間的增加，打印細胞的活力明顯下降，這可能與它對細胞的滲透壓沖擊有關；0.1M HA組和0.02M HA組30min內細胞存活率均在90%以上，60min后細胞存活率開始下降。細胞存活率的下降可能與其他更復雜的問題有關，如溫度和氧化狀態。然而，這兩種類型的生物墨水在水凝膠封裝120min后，細胞存活率甚至高于75%（圖3）。
 

圖3. dECM水凝膠包封時間對細胞存活率的影響
 

其次，研究人員對三種類型的dECM生物墨水在兩周內6個時間點的細胞存活率（圖4）和細胞增殖（圖5）進行了評估和比較，0.5M AA組在第10天，細胞存活率64±5%；0.1M HA組和0.02M HA打印后10天和14天，其中0.1M HA組的打印細胞擠在一起，活率高細胞密度更大。
 

圖4. 三種dECM生物墨水兩周內的細胞存活率

圖5. 三種dECM生物墨水打印細胞的增殖試驗
 

再次，研究人員對BMSCs在三組生物墨水中擴散進行了對比分析，擴增第14天0.1M HA組的細胞群的擴展長度最大，部分打印細胞的展布長度甚至超過100μm，0.5M AA和0.02M HA組的伸展長度均低于0.1M HA組。另外0.1M HA組打印后4天大幅收縮，打印后25天，打印的組織大約只有原來大小的四分之一，其他兩組無收縮現象。這可能是因為0.1M HA組制成的水凝膠剛度很低，另一個原因可能是凝膠速率較低，這導致了膠原纖維網絡的不穩定結構（圖6）。
 

圖6. 三種dECM生物墨水打印細胞擴散試驗
 

最后，研究人員用RT-PCR法從基因水平闡明三種dECM水凝膠對BMSCs成腱分化的影響，0.1M HA制成的dECM生物墨水打印的BMSCs與對照組相比，Scx、Tnc、COL1和Tnmd mRNA表達明顯升高。雖然在其他兩組中肌腱相關基因的表達也有升高的趨勢，但只有一些差異是顯著的�？赡苁且驗閷φ战M是商業化的I型膠原生物墨水(來自牛皮組織)，具有良好的致健能力（圖7）。
 

圖7. 三種類型dECM生物墨水包裹的BMSCs基因表達趨勢
 

結論

0.1M鹽酸的低pH值可以加速dECM粉末的消化過程。這可以使dECM水凝膠更加柔軟，其存儲模量小于100Pa，這種柔軟的dECM水凝膠促進了被其包裹的干細胞的擴散和增殖。與其他兩種更硬的dECM水凝膠相比，它也表現出更好的肌腱誘導能力。但這種過度消化的dECM水凝膠更不穩定，隨著培養時間的延長它會收縮，因此在dECM生物墨水制備過程中，選擇合適的酸性溶液類型和濃度是必要的。消化時間、酸性溶液的強度以及dECM粉末的大小和濃度之間應保持平衡。

本文來自賽業OriCell(www.oricellbio.cn)

原文檢索：
Fengyuan Zhao, Jin Cheng, Jiahao Zhang, Huilei Yu, Wenli Dai, Wenqiang Yan, Muyang Sun, Guocheng Ding, Qi Li, Qingyang Meng, Qiang Liu, Xiaoning Duan, Xiaoqing Hu, Yingfang Ao.Comparison of three different acidic solutions in tendon decellularized extracellular matrix bio-ink fabrication for 3D cell printing.Acta Biomater. 2021 Sep 1;131:262-275. doi: 10.1016/j.actbio.2021.06.026. Epub 2021 Jun 23.