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熒光定量PCR實驗中常見問題及原因分析

瀏覽次數:11037 發布日期:2021-7-28  來源:蘇州阿爾法生物官網

熒光定量PCR 是PCR實驗中常見的PCR類型,下面歸納一下,客戶進行PCR實驗時常遇見的一些問題。希望對具有PCR恐懼癥的伙伴們能有所幫助。


常見問題一: 熒光定量PCR的類型有幾種?有何區別?
答:目前熒光定量PCR實驗常用的方法主要有兩種,即:SYBR Green I染料法和Taqman探針法,兩者的主要區別在于:SYBR Green 染料的特點是只與DNA雙鏈相結合發出熒光,而當熒光染料處在游離狀態時,不會發出熒光。所以在PCR循環體系中熒光信號強度與PCR產物的數量成正比例關系。染料法熒光定量的優點是通用性比較強,幾乎適用于所有的熒光定量PCR反應但也具有明顯非特異性。如果PCR反應過程中出現引物二聚體或者進行非特異性擴增時,該染料也會這些非特異性擴增產物結合從而激發熒光,形成假陽性信號,對PCR定量結果一定的干擾,從而影響到PCR定量結果的準確性。

 


常見問題二:熒光定量實驗中無擴增曲線是什么原因導致
答:一般來說,在熒光定量PCR實驗中,無擴增曲線主要會有以下三種情況:
凝膠電泳時無條帶出現,無擴增曲線。
這種情況需要考慮引物的設計是否合理?引物質量是否正常?退火溫度設置是否合理?擴增體系是否正常等等。
2.第二種情況比較容易出現的是在做電泳時會正常顯示條帶,但沒有明顯的擴增曲線。這種情況有可能是探針合成過程出現問題;如果探針過程正常,則需要檢查探針淬火溫度、程序參數設定問題確排除后則可能是儀器故障導致。
3.另外,模板被降解或模板不足時也會出現無曲線擴增現象。

 

 

常見問題三熒光定量PCR時,有哪些需要注意的
答:在進行熒光定量PCR實驗室時,需要注意以下幾點:
1.PCR實驗室要有獨立的分區:一般PCR實驗室的樣品處理區、PCR反應制備區、PCR擴增區,數據報告區等相互獨立使用放置DNA污染;
2.配置標準品的工具,包括移液器、吸頭等單獨使用一套工具,并且移液器的吸頭是帶濾芯的標準吸頭。
3.盡量不要用記號筆或標簽在PCR管上做標記,以免影響儀器的熒光檢測
4.PCR管或8排管使用完后,及時歸入在指定的廢棄放置區,不要與試驗區域內的樣本混用。
5.每個步驟都需要做好防止DNA貨RNA污染措施。

發布者:蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司
聯系電話:0512-62956104
E-mail:jie_wu@bioalpha.cn

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