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確認RNA的質量常用的三種方法

瀏覽次數:16954 發布日期:2021-3-22  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

實時熒光定量PCR技術是通過測定RNA的轉錄水平來評估基因的活力。RNA樣本提取的質量直接影響基因表達分析。影響RNA品質的因素有以下三種:RNA濃度、RNA純度和RNA完整性。

檢測RNA濃度、純度和完整性的方式主要有以下幾種:

紫外分光光度計法:

測量260nm吸收值計算RNA濃度,測量260nm/280nm吸收值的比值,用于評估RNA純度。需要注意的是:在檢測核酸物質時應該在固定的PH溶液中進行。

260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間。<1.9,說明有蛋白質殘留;>2.1,說明RNA可能發生降解。

瓊脂糖凝膠電泳:

完整的RNA通常有三條帶,最亮的是28S條帶,其次是18S條帶,最淡的是5S條帶(部分試劑盒提取時會過濾掉5S條帶)。通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測28S和18S的比值。該方法主要用于檢測RNA的純度和完整性。

如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利,28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,我們認為RNA的質量最好。

若RNA條帶出現彌散,原因可能:RNA被核酸酶降解、電壓或電流過大、上樣量過高或過低等。

 

上述兩種方法在實驗室比較常用,此外還有幾種檢測方式供大家選擇。

熒光染料檢測:

通過熒光染料和RNA結合,熒光活性增強。此方法的靈敏度較高,主要用于檢測RNA的濃度。

微毛細管電泳:

可使用軟件的RIN(RNA Integrity Number)分數評估,10為RNA完整性最好,0為最差。此方法的靈敏度和分辨率較高,可用于檢測RNA濃度、純度和完整性。

3’-5’完整性檢測:

是在一個RNA樣本中檢測GAPDH mRNA的完整性來代表所有RNA的完整性,主要用于檢測RNA的完整性。

得到高品質RNA的小建議:

1、盡量避免RNA酶污染,使用無RNA酶的耗材和試劑,建議將擴增前后的場所分開。

2、盡量減少采樣時間,樣品處理后快速冷凍,可以加入RNA保護劑。

3、RNA提取過程中可以使用RNA酶抑制劑。

4、存儲過程中避免反復凍融。

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發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
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