1.樣品的準備。
取適量待測定的抑制劑樣品，用Assay Buffer或DMSO等適當的溶劑配制成適宜濃度的溶液，如果有必要可配制成適當的濃度梯度待用。

2.陽性對照的準備。
本試劑盒提供的陽性對照抑制劑Ebselen濃度為10mM，配制在DMSO中，可以根據需要使用與待測抑制劑一樣的溶劑稀釋成所需濃度或濃度梯度。通常Ebselen的IC₅₀約為0.5μM-2μM，使用本試劑盒時Ebselen的抑制效果參考圖2。

3.樣品測定。
a.根據樣品數量(含相關對照)，參考下表配制適量的Assay Reagent。注：由于2019-nCoV M^pro/3CL^pro的甘油含量較高，微量吸取時要注意避免吸頭吸附損失并吹打完全，加入2019-nCoV M^pro/3CL^pro后需要注意充分混勻。

a.參考下表，使用96孔黑板設置各組別，并按照下表依次加入檢測試劑和樣品。加入待測樣品后，混勻。為獲得更加可靠的檢測結果，建議每個樣品至少應該進行2個重復孔的檢測。

注：樣品溶劑是指配制和稀釋待測抑制劑所用的溶劑。
b.各孔快速加入Substrate 2μl，混勻。注：加入Substrate后反應會立即開始，如果孔數較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時間差而導致的誤差，混勻操作可在培養板振蕩器上進行。
c.37℃避光孵育5分鐘后信號即趨于穩定，可在5-20分鐘內使用多功能酶標進行熒光測定。激發波長為340nm，發射波長為490nm。當熒光讀數偏低時，也可適當延長孵育時間至20-30分鐘。
注：也可在步驟a中將待測樣品加入后37℃孵育10分鐘，再將Substrate加入反應體系中。37℃孵育10分鐘再加入Substrate可能會降低抑制劑的IC₅₀。建議通過預實驗確定未知抑制劑比較適合的孵育時間。

4.計算:
a.計算每個樣品孔和空白對照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU_空白對照、RFU_{100%酶活性對照}、RFU_陽性對照和RFU_樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。
b.計算每個樣品的抑制百分率。計算公式如下：
抑制率(%) = (RFU_{100%酶活性對照} - RFU_樣品) / (RFU_{100%酶活性對照} - RFU_空白對照) × 100%
c.對于檢測發現有效的抑制劑，通過檢測該抑制劑的劑量效應就可以計算出該抑制劑的IC₅₀。使用本試劑盒檢測Ebselen對于2019-nCoV M^pro/3CL^pro的抑制作用的檢測結果參考圖2，Substrate直接加入反應體系中，然后孵育5分鐘進行熒光測定，IC₅₀約為0.62μM。

圖2. 新型冠狀病毒(2019-nCoV) M^pro/3CL^pro抑制劑篩選試劑盒(增強型)檢測Ebselen的效果圖。實際檢測結果可能會因樣品和檢測條件等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。