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Naica自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在HPV檢測(cè)的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):1809 發(fā)布日期:2020-3-6  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)


 

人類(lèi)DNA中HPV16和HPV18的靈敏度和特異性檢測(cè)
 

全世界有超過(guò)5%的癌癥是因人乳頭瘤病毒(HPV)導(dǎo)致的,它主要通過(guò)性傳播的方式感染[1]。十多種HPV亞型由于其在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用以及宮頸癌和口咽癌發(fā)病率的增加而被認(rèn)為是高風(fēng)險(xiǎn)的。在這些亞型中,HPV16和HPV18是最普遍的,在大約70%的宮頸癌和90%的口咽癌中均能檢測(cè)到[1]。HPV16和18通過(guò)將其病毒序列的片段(包括致癌的E6和E7區(qū)域)整合到細(xì)胞基因組中,從而使細(xì)胞永生并轉(zhuǎn)化。使用能夠區(qū)分高危型HPV和低危型HPV的靈敏而特異的分子技術(shù),進(jìn)行早期HPV檢測(cè)對(duì)于治療癌前病變和預(yù)防宮頸癌進(jìn)展至關(guān)重要。在這里,我們展示了使用3色熒光通道NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上的檢測(cè)方法(表1)如何可靠地檢測(cè)和定量人類(lèi)DNA樣品中的HPV16,HPV18和人類(lèi)參考基因ALB(圖1)。
 

表1

使用優(yōu)化的3色NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行HPV分析,在僅包含人類(lèi)野生型基因組DNA(最終濃度為400 cp /μL)的36個(gè)重復(fù)樣品中,未檢測(cè)到假陽(yáng)性,空白限為0。在以人類(lèi)野生型DNA(最終濃度為400 cp /μL)為背景下對(duì)合成的HPV16和HPV18 DNA進(jìn)行系列稀釋?zhuān)⑦M(jìn)行了3次重復(fù),結(jié)果檢測(cè)到HPV16和HPV18基因在95%的置信水平下,最終濃度降至每微升0.2個(gè)拷貝,突變等位基因頻率為0.05%(圖2)。
 

圖1

Crystal Miner軟件生成的3D點(diǎn)圖,圖中同時(shí)顯示檢測(cè)到的HPV16、HPV18和ALB參考基因。熒光基團(tuán)名稱(chēng)顯示在括號(hào)中。
 


3色NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測(cè)(A)HPV16和(B)HPV18靶標(biāo)的線性和靈敏度。在400 cp/μL WT-DNA(10000拷貝/25μL反應(yīng))的背景下,對(duì)HPV16和HPV18的連續(xù)稀釋樣本進(jìn)行了3次測(cè)定,稀釋范圍為20-0.2 cp/μL(500-5拷貝/25μL反應(yīng))。豎線表示95%置信區(qū)間下的濃度范圍。

 

患者樣本中穩(wěn)健的HPV16和HPV18檢測(cè)
 

采用3色熒光通道NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)技術(shù),利用HPV試劑盒對(duì)4例口咽癌患者福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織和4例非HPV感染的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者FFPE組織中提取的DNA進(jìn)行分析(表2)。口咽部FFPE樣本先前使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行了檢測(cè)[2]。采用3色NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測(cè)的4份HPV16和HPV18樣本均為陽(yáng)性,非HPV樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性。
 

 

表2

癌癥患者FFPE DNA樣本中HPV16和HPV18的定量。結(jié)果以sapphire芯片中的每微升拷貝數(shù)(最終濃度)給出。


應(yīng)用說(shuō)明亮點(diǎn)
 

♦ 3色熒光通道NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)能夠同時(shí)檢測(cè)和定量HPV16和HPV18以及人類(lèi)參考基因ALB。

♦ 在每25μL反應(yīng)10000個(gè)拷貝的野生型DNA背景下,盡管突變等位基因的頻率為0.05%,HPV16和HPV18依然能夠精準(zhǔn)的被檢測(cè)到,并且在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到假陽(yáng)性。

♦ 在連續(xù)稀釋實(shí)驗(yàn)中,3色HPV檢測(cè)顯示預(yù)期和測(cè)量的HPV16和HPV18濃度之間存在良好的相關(guān)性。

♦ 3色熒光通道NaicaTM自動(dòng)化微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)成功地檢測(cè)出口咽癌患者FFPE腫瘤標(biāo)本DNA中HPV16和HPV18。

發(fā)布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
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